Σκοπός: Η μεθυλίωση DNA σε περιοχές γονιδιακών υποκινητών έχει παρατηρηθεί σε αρκετά είδη καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου και του Καρκίνου του Μαστού. Ένα πρωτόκολλο Methylation Specific PCR (MSP) σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε σε κλινικά δείγματα Αναρρόφησης δια λεπτής βελόνης (Fine Needle Aspiration Biopsy, FNAB) μαστού, ενός βιολογικού υλικού που έχει ελάχιστα χρησιμοποιηθεί στην βιβλιογραφία, για να προσδιοριστούν τα επίπεδα μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων CND2, APC, HIN1 & CDH13 και να εκτιμηθεί το κατά πόσο αυτό το πολυγονιδιακό πάνελ μεθυλίωσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για την ανίχνευση του Καρκίνου του Μαστού σε ελληνικό πληθυσμό. Μέθοδοι: Οι 104 συμμετέχοντες υπεβλήθησαν σε FNAB το υλικό της οποίας εκτιμήθηκε κυτταρολογικά για κακοήθεια μαστού ή μη και χρησιμοποιήθηκε για την περαιτέρω επιγενετική ανάλυση. Έγινε απομόνωση του DNA από τα κλινικά δείγματα FNAB μαστού και στη συνέχεια ακολούθησε η μετατροπή του παρουσία όξινου θειώδους νατρίου (bisulfite conversion). Οι αντιδράσεις MSP έγιναν με εκκινητές (primers) ειδικούς είτε για την μεθυλιωμένη είτε για τη μη μεθυλιωμένη κατάσταση για καθένα από τα 4 υπό μελέτη γονίδια. Τα τελικά MSP-προϊόντα αναλύθηκαν σε 2% πήκτωμα αγαρόζης με ηλεκτροφόρηση. Αποτελέσματα: Υπερμεθυλίωση παρατηρήθηκε στο 74%, 69.2%, 59.6% και 63.4% των δειγμάτων για τα γονίδια CND2, HIN1, APC και CDH13 αντιστοίχως. Το γονίδιο CND2 ήταν το πιο συχνά μεθυλιωμένο στα περιστατικά με κυτταρολογική διάγνωση κακοήθειας (90%) και τα γονίδια APC και HIN1 στα περιστατικά διαγνωσμένα ως ύποπτα για κακοήθεια (88.2%). Σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της ιστολογικής διάγνωσης και των συχνοτήτων μεθυλίωσης όλων των γονιδίων μελέτης (p-values<0.001). Βρέθηκε ότι ο σχετικός κίνδυνος (Odds Ratio) για κακοήθεια μαστού ήταν 8.267 για το γονίδιο CND2, 5.235 για το γονίδιο APC, 7.852 για το γονίδιο HIN1 and 22.920 για το γονίδιο CDH13, υποδηλώνοντας την θετική συσχέτιση της μεθυλίωσης των 4 γονιδίων με την εμφάνιση κακοήθειας μαστού. Επίσης, υπολογίστηκαν οι διαγνωστικές παράμετροι για κάθε γονίδιο και τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο συνδυασμός των τεσσάρων γονιδίων σε ένα πολυγονιδιακό πάνελ μεθυλίωσης αυξάνει σημαντικά την Ειδικότητα (Specificity) και Θετική Προγνωστική Αξία (Positive Predictive Value) συγκριτικά με την μεθυλίωση οποιουδήποτε μεμονωμένου εκ των τεσσάρων γονιδίων. Συμπεράσματα: Η μελέτη αυτή δείχνει ότι η FNAB μαστού σε συνδυασμό με τα δεδομένα μεθυλίωσης από τα αναρροφημένα κυτταρολογικά υλικά μαστού εμφανίζουν πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα όσον αφορά την χρήση τους ως βιοδείκτη για την πρώιμη ανίχνευση του κινδύνου για Καρκίνο του Μαστού σε γυναίκες με ύποπτες αλλοιώσεις μαστού.
Purpose: Aberrant DNA methylation in promoter regions has been found in many cancers, including Breast Cancer (BC). A Methylation Specific PCR (MSP) was applied in breast Fine Needle Aspiration Biopsy (FNAB) material, which has been rarely used in the literature, to estimate the methylation status of CND2, APC, HIN1 & CDH13 and to assess whether this multiplex methylation panel can be possibly used as an indicator-biomarker for BC detection in a Greek population. Methods: All 104 participants were subjected to FNAB and both cytological evaluation for possible breast malignancy and epigenetic analysis were carried out. DNA was extracted from FNAB samples and was subjected to bisulfite conversion. MSP was carried out with primers specific for either the methylated or unmethylated status for each gene. The final MSP-products were analyzed in 2% agarose gels with electrophoresis. Results: Hypermethylation was observed in 74%, 69.2%, 59.6% and 63.4% of samples for CND2, HIN1, APC and CDH13 respectively. CND2 was the most hypermethylated in cases cytologically diagnosed as malignant (90%) and APC and HIN1 in cases cytologically diagnosed as suspicious of malignancy (88.2%). A significant correlation between histologic evaluation and the methylation frequencies for all 4 genes was calculated (p-values<0.001). Odds Ratio for breast malignancy was 8.267 for CND2, 5.235 for APC, 7.852 for HIN1 and 22.920 for CDH13, underlying that their methylation is positively related to breast malignancy. Also, it seems that the combination of all genes into a multiplex methylation panel has significantly higher Specificity and Positive Predictive Value than any single gene methylation state. Conclusions: Our study shows that breast FNAB combined with methylation data from the collected aspirates has a promising potential as a biomarker for the early detection of BC risk in women with suspicious lesions.
National Documentation Centre (EKT)
