Κρυσταλλική δομή της ασεκυλοτρανσφερασης της χλωραμφενικόλης τύπου Ι από την E.Coli σε απονενζυμική μορφή και σε σύμπλοκο με τον αναστολέα φουσιδικό οξύ

Crystal structure of type I chloramphenicol acetyl transferase in apoenzyme form and complexed with inhibitor fusidic acid

Ροΐδης, Αλέξανδρος

Το φαινόμενο της εμφάνισης βακτηριακών στελεχών ανθεκτικών στα αντιβιοτικά έχει μεγάλο ενδιαφέρον και τεράστιες κλινικές προεκτάσεις. Τα βακτήρια καθίστανται ανθεκτικά στα αντιβιοτικά με πολλούς τρόπους. Από αυτούς μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ενζυμική τροποποίηση των αντιβιοτικών. Η ανθεκτικότητα στη χλωραμφενικόλη επιτυγχάνεται μέσω ενζυμικής ακετυλίωσης στο πρωτοταγές υδροξύλιο του αντιβιοτικού. Ο δότης της ακέτυλό ομάδας είναι το ακέτυλο συνένζυμο Α. Η ακετυλίωση της χλωραμφενικόλης εμφανίζεται σε πολλά βακτηριακά είδη και οφείλεται στην δράση μιας οικογένειας εξελικτικά συντηρημένων ενζύμων τα οποία χαρακτηρίζονται σαν ακέτυλο τρανσφεράσες της χλωραμφενικόλης. Στα εντεροβακτήρια η ενζυμική ακετυλίωση της χλωραμφενικόλης καταλύεται από τρείς διακριτούς ενζυμικούς τύπους (CATI, CATII, CATIII). Η ακέτυλο τρανσφεράση της χλωραμφενικόλης τύπου Ι προσδίδει ανθεκτικότητα όχι μόνο στη χλωραμφενικόλη αλλά και στο ευρέως χρησιμοποιούμενο αντιβιοτικό φουσιδικό οξύ., το οποίο αναστέλει συναγωνιστικά το ένζυμο μέσω μη αντιστρεπτής σύνδεσης με το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Παρά το γεγονός ότι το φουσιδικό οξύ δεν τροποποιείται χημικά από το ένζυμο η απομάκρυνση του από το κυτταρόπλασμα προσδίδει ανθεκτικότητα. Εκτός από το φουσιδικό οξύ η ακέτυλο τρανσφεράση της χλωραμφενικόλης Ι δεσμεύει και χρωστικές όπως το crystal violet , οι οποίες ανήκουν στην κατηγορία των triphenyl methane χρωστικών. Προκειμένου να διερευνήσουμε τον μηχανισμό ανθεκτικότητας στην χλωραμφενικόλη και στο φουσιδικό οξύ προσδιορισαμε την κρυσταλλική δομή της ακέτυλο τρανσφεράσης της χλωραμφενικόλης τύπου Ι σε αποενζυμική μορφή και σε σύμπλοκο με το φουσιδικό οξύ. Η βιολογικά ενεργή μονάδα του ενζύμου είναι ένα ομοτριμερές, το οποίο εμφανίζει μια μικτή α/β δομή. Το κύριο δομικό χαρακτηριστικό το τριμερούς είναι μια εκτεταμένη β πτυχωτή επιφάνεια η οποία διατρέχει το μοριακό πυρήνα του ενζύμου και περιβάλλεται από α-έλικες οι οποίες την υποστηρίζουν και έρχονται σε επαφή με τον διαλύτη. Το ενεργό κέντρο του ενζύμου σχηματίζεται στην μεσεπιφάνεις αλληλεπίδρασης των μονομερών με αποτέλεσμα να υπάρχουν τρία ενεργά κέντρα στο τριμερές τα οποία μπορούν να λειτουργούν ανεξάρτητα καταλύοντας την αντίδραση ακετυλίωσης μέσω τυχαίας σειράς δέσμευσης του υποστρώματος και του συνενζύμου Α. Η δέσμευση του φουσιδικού οξέος στο ενεργό κέντρο του ενζύμου γίνεται μέσω ενός καλά καθορισμένου δικτύου υδρογονικών δεσμών οι οποίοι σχηματίζονται μεταξύ των πολικών ομάδων του μορίου του αναστολέα και πολικών καταλοίπων του ενεργού κέντρου. Η δέσμευση του αναστολέα σταθεροποιείται επιπλέον μέσω υδρογονικών δεσμών με μόρια νερού τα οποία καταλαμβάνουν καθορισμένες θέσεις μέσα στο ενεργό κέντρο. Μέσα την κρυσταλλογραφική ασύμμετρη μονάδα εμφανίζονται σχέσεις μη κρυσταλλογραφικής συμμετρίας. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η ύπαρξη ενός κατιόντος ασβεστίου το οποίο συμμετέχει σε σχηματισμό χηλικού συμπλόκου και επτά υποκαταστάτες υιοθετώντας διαμόρφωση πενταγωνικής διπυραμίδας. Τέλος συγκριτική ανάλυση της δομής της CATI αποδεικνύει την συντήρηση το δομικού προτύπου των ακετυλοτρανσφερασών της χλωραμφενικόλης και σε άλλες λειτουργικά άσχετες πρωτεϊνες οι οποίες εμφανίζουν πολύ χαμηλό ποσοστό ομολογίας σε επίπεδο πρωτοταγούς δομής. (EL)

The phenomenon of antibiotic resistance in bacterial species is of major importance with clinical and ecological implications. Bacteria exhibit resistance to antibiotics via different pathways. Among these the enzymatic inactivation of antibiotics is of great interest. Resistance to chloramphenicol,a widely used antibiotic, is achieved via enzymatic acetylation of the primary hydroxyl group of the antibiotic compound.The acetyl group donor is acetyl coenzyme A. Acetylation of chloramphenicol occurs in many bacterial species due to the action of a family of evolutionary related enzymes which are chloramphenicol acetyltransferases. In Enterobacteria enzymatic acetylation of chloramphenicol is performed by three distinct variants form of the enzyme namely CATI, CATII and CATIII. Type I variant not only confers resistance to chloramphenicol but also to the widely used steroidal antibiotic fusidic acid, which acts as an inhibitor of the enzyme. Although CATI is inhibited by fusidic acid, by non reversible binding of the steroid to the active site, it confers resistance to the antibiotic by sequestering it from the cytoplasm. This extraordinary molecular selectivity of CATI is of great interest. In order to explore the mechanism of antibiotic resistance to chroramphenicol and to fusidic acid we have determined the crystal structure of type I chloramphenicol acetyltransferase CATI in apoenzyme form and complex with inhibitor fusidic acid. The three dimensional structure of CATI reveals a homotrimeric organization of the enzyme. The enzyme crystallizes in space group P21 and there are four trimers in the crystallographic asymmetric unit. The enzyme has a mixed α/β structure. The central structural element is an extended beta pleated sheet which spans the entire trimer molecular core and is surrounded by alpha helices which support the above mentioned sheet and make contacts with the solvent. The active sites of the enzyme are formed by amino acid residues belonging to adjacent subunits. Due to the homotrimeric structure of the enzyme there are three active sites, which can operate independently by random addition of the substrate and acetyl coenzyme A. The binding of fusidic acid is achieved through specific hydrogen bonding of the steroid molecule with the side chains of polar amino acid residues that protrude into the active site, as well as with ordered solvent molecules that occupy well defined space in the active site of the enzyme. The binding of the inhibitor is stabilized by non polar interactions with a number of hydrophobic amino acid residue mainly Phenylalanines which participate in π-stacking with the extended ring network of fusidic acid. The structure of the enzyme reveals complex non crystallographic symmetry between the four trimers. There are three twofolds local axis which relate the trimers by 1800 rotation. A calcium cation participates in the formation of one local axis. The chelating complex of the calcium cation consist of seven groups which adopt a pentagonal bipyramid geometry, which has been reported for other structures. Finally comparative analysis of the three dimensional structure of CATI reveals that the folding pattern common to chloramphenicol acetyltransferases is conserved in other functionally unrelated proteins which exhibit low levels of primary sequence homology with the afformentioned enzymes. Such findings suggests that mechanisms of folding conservation operate evolutionary and must be taken into account in the classification of protein structures. The structure of CATI complexed with fusidic acid not only explains the mechanism of resistance to this antibiotic but can also yield structural information for rational design of novel antibiotics based on fusidic acid that do not bind to CATI. Furthermore the mode of binding of fusidic yields novel insights in the architecture of steroid binding proteins. (EN)

Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές

text

Ένζυμα

Αντιβιοτικά

Ακετυλοτρανσφεράση

Χλωραμφενικόλη

Ανθεκτικότητα

Φουσιδικό οξύ

Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ

Πανεπιστήμιο Κρήτης

E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο

Elocus

Ελληνική γλώσσα

2004-03-11

2004-04-20

http://elocus.lib.uoc.gr:443/dlib/0/b/e/metadata-dlib-2004roidis.tkl

uch.biology.phd//2004roidis

Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές