Η καταπόνηση στους ιχθείς έχει τρία στάδια: Πρώτον, υπάρχει μια αντίδραση συναγερμού που είναι η αρχική απόκριση στο ερέθισμα, η οποία ακολουθείται από ένα στάδιο αντίστασης καθώς ο οργανισμός προσαρμόζει ή εξισορροπεί την διαταραχή ώστε να ανακτήσει την ομοιόσταση. Αν ο οργανισμός δεν μπορεί να αντιμετωπίσει επιτυχώς την προκύπτουσα καταπόνηση, ακολουθεί το τρίτο στάδιο, δηλαδή εξάντληση, η οποία μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας παθολογικής κατάστασης ή το θάνατο. Σήμερα είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο ότι η κύρια απόκριση στην καταπόνηση είναι νευροενδοκρινικής φύσεως. Η ενδοκρινική απόκριση στην καταπόνηση περιλαμβάνει χαρακτηριστικές κορτικοστεροειδείς αποκρίσεις και απελευθέρωση κατεχολαμινών. Ο νευροενδοκρινικός έλεγχος των δυο αυτών ορμονικών αξόνων κατά τη διάρκεια της καταπόνησης φαίνεται να είναι αλληλοσχετιζόμενος. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη και αξιολόγηση δεικτών εκτίμησης της καταπόνησης στο φαγκρί (Pagrus pagrus). Πιο συγκεκριμένα τα αντικείμενα της μελέτης είναι: α) η ανάπτυξη και αξιολόγηση της ραδιοανοσολογικής μεθόδου προσδιορισμού της κορτιζόλης και η αξιολόγηση της ραδιοανοσολογικής μεθόδου προσδιορισμού των κατεχολαμινών (νορεπινεφρίνης και επινεφρίνης), β) η αξιολόγηση νέων δεικτών εκτίμησης οξείας και χρόνιας καταπόνησης (όπως ο χρόνος προθρομβίνης, το χρώμα του δέρματος και η συγκέντρωση μελανίνης στο δέρμα) και γ) ο καθορισμός τιμών εκκίνησης ή αλλιώς τιμών ηρεμίας (baseline ή resting values) για τους παραπάνω δείκτες αλλά και για κλασσικούς δείκτες καταπόνησης, όπως η γλυκόζη, το γαλακτικό οξύ και οι ηλεκτρολύτες. Πριν από την διεξαγωγή των πειραμάτων καταπόνησης, διενεργήθηκαν πειράματα αναισθησίας, όπου ελέγχθηκαν τα αναισθητικά 2-φαινοξυαιθανόλη και γαρυφαλέλειο. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων αναισθησίας και τις συμπεριφορικές αποκρίσεις των ατόμων φαίνεται ότι η 2-φαινοξυαιθανόλη είναι το αναισθητικό επιλογής για το είδος Pagrus pagrus. Η απόκριση σε οξεία καταπόνηση, με σύλληψη και έκθεση στον αέρα (συγχρωτισμός), της γλυκόζης, γαλακτικού οξέος, κατεχολαμινών (Ε, ΝΕ), κορτιζόλης, ηλεκτρολυτών (Κ, Να), χρόνου προθρομβίνης (PT) παρουσίασε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των καταπονημένων και μη ατόμων. Τα μη καταπονημένα ψάρια, που υπέστησαν το κατέβασμα του ύδατος της δεξαμενής με σιφόνι πριν τη δειγματοληψία, παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά μειωμένες τιμές στα επίπεδα κατεχολαμινών και ιόντων καλίου του πλάσματος, σε σύγκριση με τα μη καταπονημένα άτομα (control). Οι συγκεντρώσεις της κορτιζόλης και του γαλακτικού οξέος στο πλάσμα, παρέμειναν υψηλές μέχρι και 2 ώρες μετά το επεισόδιο οξείας καταπόνησης (πολύ γρήγορο άδειασμα του ύδατος της δεξαμενής και έκθεση εκτός ύδατος για 1 λεπτό), ενώ επανήλθαν στις τιμές εκκίνησης μετά το πέρας του πρώτου εικοσιτετραώρου. Τα επίπεδα της γλυκόζης, των κατεχολαμινών, της κορτιζόλης και της οσμωτικής πίεσης, δεν παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές, μεταξύ των πυκνοτήτων εκτροφής (5-25kg/L), ενώ τα επίπεδα του γαλακτικού οξέος, της ποσότητας μελανίνης στο δέρμα και των ιόντων νατρίου παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων χαμηλής (LD) και υψηλής πυκνότητας (HD) και της ομάδας χαμηλής πυκνότητας και χαμηλού διαθέσιμου όγκου (LDLV). Το χρώμα του δέρματος δεν παρουσιάζει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων χαμηλής (LD) και υψηλής πυκνότητας (HD), ενώ παρουσιάζει διαφορά μεταξύ αναισθητοποιημένων και μη ατόμων τα οποία είχαν φωτεινότερο χρώμα δέρματος. Οι διαφορετικές φυσιολογικές αποκρίσεις στην καταπόνηση μεταξύ των ομάδων χαμηλής (LD) και υψηλής πυκνότητας (HD) με την ομάδα χαμηλής πυκνότητας και χαμηλού διαθέσιμου όγκου (LDLV), οφείλεται στον σχετικό όγκο, που είναι ο όγκος που καταλαμβάνει ο πληθυσμός των ιχθύων στον συνολικό όγκο του ύδατος της δεξαμενής και τις κοινωνικές αλληλεπιδράσεις που δημιουργούνται. Σε απόκριση στις διαφορετικές θερμοκρασίες ύδατος (15-19-21ο C), τα επίπεδα γλυκόζης βρέθηκαν σημαντικά χαμηλότερα στην ομάδα Τ-15, ενώ του γαλακτικού οξέως βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερα στην ίδια ομάδα. Τα επίπεδα νορεπινεφρίνης και κορτιζόλης βρέθηκαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα Τ-25 και η νορεπινεφρίνη χαμηλότερη στην ομάδα Τ-19. Τα επίπεδα των ηλεκτρολυτών και του pH των μυών δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων. Το χρώμα του δέρματος ήταν φωτεινότερο στην ομάδα Τ-19 και στα μη αναισθητοποιημένα άτομα. Τέλος οι τιμές εκκίνησης εκτιμήθηκαν ως εξής: Γλυκόζη: 2,01-5,21 mmole L-1, Γαλακτικό: 0,09-1,95 mmol L-1, Επινεφρίνη: 0,39-5,61 ng ml-1, Νορεπινεφρίνη: 1,37-9,77 ng ml-1, Κορτιζόλη: 0,95-22,93 ng ml-1, Κάλιο: 2,00-4,51 mmole L-1, Νάτριο: 166,96-196,17 mmole L-1, Οσμωτική πίεση: 288,40-302.41 mOsm Kg-1, Χρόνος προθρομβίνης: 6,78-17,44 sec, Ποσότητα μελανίνης στο δέρμα: 2.78-5,58 μg/mm2. Τα συμπεράσματα που εξάγονται από την παρούσα μελέτη είναι: Η κορτιζόλη αποδεικνύεται καλός δείκτης οξείας καταπόνησης αλλά όχι και χρόνιας καταπόνησης. Επιπλέον οι τιμές της κορτιζόλης παρουσιάζουν μεγάλη τυπική απόκλιση μέσα στους πληθυσμούς γεγονός που, αφού αποκλείσθηκε η πιθανότητα να οφείλεται στην μέθοδο προσδιορισμού, παραπέμπει στον διαχωρισμό των ατόμων σε ομάδες υψηλής και χαμηλής απόκρισης στην κορτιζόλη. Η παραπάνω υπόθεση χρειάζεται φυσικά περαιτέρω διερεύνηση. Από την άλλη πλευρά οι κατεχολαμίνες και ιδιαίτερα η νορεπινεφρίνη, εμφανίζεται καλός δείκτης οξείας αλλά και χρόνιας καταπόνησης, παρά τις δυσκολίες στον προσδιορισμό της. Αποδεικνύεται στην παρούσα μελέτη ότι με τον κατάλληλο σχεδιασμό των πειραμάτων και των χειρισμών κατά την δειγματοληψία, είναι δυνατόν να προσδιορισθούν με επιτυχία οι κατεχολαμίνες. Η γλυκόζη επίσης αποτελεί αξιόπιστο δείκτη οξείας καταπόνησης, ενώ δεν συμβαίνει το ίδιο και για την χρόνια καταπόνηση, όπου παραμένει πάντα εντός των ορίων των τιμών εκκίνησης. Το γαλακτικό οξύ αποδεικνύεται αξιόπιστος δείκτης οξείας καταπόνησης, αλλά και χρόνιας καταπόνησης, Οι ηλεκτρολύτες και κυρίως το κάλιο εμφανίζεται αξιόπιστος δείκτης οξείας καταπόνησης, αλλά όχι και χρόνιας καταπόνησης, όπου παραμένουν πάντα εντός των ορίων των τιμών εκκίνησης. Ο χρόνος προθρομβίνης εμφανίζεται στην παρούσα μελέτη ως αξιόπιστος δείκτης οξείας καταπόνησης κατά την οποία τα επίπεδα του μειώνονται και εμφανίζουν αρνητική συσχέτιση με τα επίπεδα της κορτιζόλης και της γλυκόζης. Η ποσότητα μελανίνης στο δέρμα σχετίζεται με την χρόνια καταπόνηση και πιθανόν να αποδειχθεί αξιόπιστος δείκτης χρόνιας καταπόνησης. Το χρώμα του δέρματος επηρεάζεται από την θερμοκρασία του ύδατος και είναι φωτεινότερο στους 19οC, ενώ δεν διαφέρει μεταξύ υψηλής και χαμηλής πυκνότητας, επιδεικνύοντας έτσι αξιοπιστία ως δείκτης χρόνιας καταπόνησης. Επιπλέον σε όλα τα πειράματα της παρούσης μελέτης τα μη αναισθητοποιημένα άτομα του φαγκριού έχουν φωτεινότερο χρώμα δέρματος, επιδεικνύοντας αναμφισβήτητα την επίδραση της αναισθησίας στο χρώμα του δέρματος. Ένα επιπλέον συμπέρασμα που εξάγεται από την παρούσα μελέτη είναι ότι δεν αρκεί ο χαρακτηρισμός της πυκνότητας σε kg/m3, για τον καθορισμό των επιπτώσεων αυτής στην φυσιολογική απόκριση των ψαριών. Ο σχετικός όγκος, που καταλαμβάνει ο πληθυσμός των ιχθύων στον συνολικό διαθέσιμο όγκο ύδατος της δεξαμενής και οι κοινωνικές αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται, είναι υπεύθυνες για την διαφορά στην φυσιολογική απόκριση των ομάδων. Επιπλέον το φαγκρί εμφανίζεται ανθεκτικό σε υψηλές πυκνότητες εκτροφής, γεγονός που αποτελεί πλεονέκτημα για την καλλιέργεια του είδους. Υπάρχει όμως και η πιθανότητα οι πυκνότητες που χρησιμοποιήθηκαν να ήταν χαμηλές για το συγκεκριμένο είδος. Επιπλέον από την παρούσα μελέτη φαίνεται η καταπόνηση του φαγκριού κατά την παραμονή του στα ενυδρεία, η οποία γίνεται φανερή από τις υψηλές τιμές των κατεχολαμινών και του γαλακτικού οξέος του πλάσματος. Τέλος η αφαίρεση του ύδατος της δεξαμενής με σιφόνι στο 1/3 του όγκου, 10-15 λεπτά πριν από την δειγματοληψία δεν φαίνεται να βοηθάει ιδιαίτερα στην μείωση της απόκρισης στην καταπόνηση, παρά μόνο να διευκολύνει τον χειριστή στην σύλληψη των ζώων. Σε ερευνητικό επίπεδο υπάρχει η πιθανότητα, σε περίπτωση που τα ψάρια υφίστανται συχνά τον χειρισμό αυτόν, να εθιστούν στην καταπόνηση λόγω μειωμένης στάθμης του ύδατος και αυτό να επηρεάσει τα αποτελέσματα εργασιών.
(EL)
The aim of the present study was to develop and evaluate reliable stress indicators in the red porgy, Pagrus pagrus. Specific objectives were (i) to develop a radioimmunoassay for the determination of cortisol, (ii) to evaluate a commercial assay for the determination of catecholamines (Epinephrine and Norepinephrine), (iii) to develop new indicators of acute and chronic stress (prothrombin time, skin colour and concentration of melanin in the skin), and (iv) set baseline values for all stress indicators. The first experiment concerned the evaluation of the use of two anesthetics, 2-phenoxyethanol and clove oil. 2-phenoxyethanol was found to be the most convenient anesthetic for red porgy. The second experiment was to define the response of red porgy to acute (capture and exposure to the air for 3min) and chronic stressors (different stocking density: 5 vs. 25kg/m3; and different water temperatures: 15-19-25oC). Cortisol and lactate were found to be reliable stress indicators of acute stress, presenting elevated concentrations for the first two hours after exposure to the stress stimuli and been declined to resting values after 24h. Catecholamines, glucose, electrolytes, and prothrombin time were also found to be reliable indicators for acute stress, whereas catecholamines, lactate, skin colour and concentration of melanin in the skin, were found to be reliable indicators for chronic stress. Skin colour also exhibited a remarkable relationship with chronic stress with skin being brighter (L*) in non anesthetized fish and in individuals acclimated in 19oC water temperature. Baseline values were determined as follow: Glucose, 2.01-5.21 mmole L-1; Lactate, 0.09-1.95 mmol L-1; Epinephrine, 0.39-5.61 ng ml-1; Norepinephrine, 1.37-9.77 ng ml-1; Cortisol, 0.95-22.93 ng ml-1; K+, 2.00-4.51 mmole L-1; Na+, 166.96-196.17 mmole L-1, Osmotic pressure, 288.4-302.4 mOsm Kg-1, and Prothrombin time, 6.78-17.44 sec. The present study also revealed that density by means of kg/m3, is not an appropriate term to describe the physiological condition of fish (stress). Relative volume, i.e. the volume that the population of the fish occupy within the total water volume, seems to be more appropriate to describe the social interactions between individuals, and thus the stress response. In addition, water temperature (15 and 25 oC) is an important environmental stressor for Pagrus pagrus, as shown by the elevated of catecholamines and lactate concentrations in plasma.
(EN)
