Ταυτοποίηση κυτταρικών πληθυσμών που συμμετέχουν στην αναγέννηση των άκρων μέσω επαγωγής κυτταρικού θανάτου

RDF 

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Αποθετήριο :
E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο



Σημασιολογικός εμπλουτισμός/ομογενοποίηση από το EKT
2012 (EL)
Targeted cell ablation towards the identification of cell populations that participate in regeneration
Ταυτοποίηση κυτταρικών πληθυσμών που συμμετέχουν στην αναγέννηση των άκρων μέσω επαγωγής κυτταρικού θανάτου

Κολτσάκη, Ιωάννα

Αβέρωφ, Μιχαήλ

Η επαγωγή κυτταρικού θανάτου αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο για το καθορισμό του ρόλου διαφορετικών κυτταρικών τύπων στην ανάπτυξη και αναγέννηση. Ένα χημικό-γενετικό σύστημα βασίζεται στη χρήση του βακτηριακού ενζύμου, νιτροαναγωγάσης (nitroreductase, NTR). Η νιτραναγωγάση ανάγει το υπόστρωμα Μετρονιδαζόλη (Metronidazole, Mtz) και το μετατρέπει σε κυτταροτοξικό μεταβολίτη προκαλώντας κυτταρικό θάνατο. Το σύστημα NTR/Mtz έχει εφαρμοστεί επιτυχώς στο Danio rerio και στο Mus musculus, υποδεικνύοντας το ως αποτελεσματικό εργαλείο σε διαφορετικούς οργανισμούς. Εφαρμόσαμε το NTR/Mtz σύστημα στο αμφίποδο καρκινοειδές Parhyale hawaiensis, το οποίο αποτελεί αναδυόμενο μοντέλο-οργανισμός για τη μελέτη της αναγέννησης των άκρων με πληθώρα γενετικών εργαλείων. Διαγονίδια που έφεραν ιστοειδικούς υποκινητές ανοδικά του cfp-ntr γονιδίου, όπου η νουκλεοτιδική αλληλουχία του ενζύμου NTR έχει συζευχθεί με τη νουκλεοτιδική αλληλουχία της κυανής φθορίζουσας πρωτεΐνης (Cyan fluorescent protein, CFP), εντέθηκαν στο γονιδίωμα του Parhyale με τη χρήση του Minos μεταθετού στοιχείου, με αποτέλεσμα την έκφραση της συζευγμένης πρωτεΐνης σε κύτταρα συγκεκριμένου κυτταρικού τύπου. Η παρουσία της φθορίζουσας πρωτεϊνης CFP (Cyan Fluorescent Protein) επιβεβαίωνε την έκφραση του διαγονιδίου και τη παρουσία της πρωτεΐνης στα υπό-μελέτη κύτταρα. Επιπλέον, τα μωσαϊκά ζώα που έφεραν τα διαγονίδια παρουσίαζαν φυσιολογική ανάπτυξη. Προσθέτοντας το υπόστρωμα της νιτροαναγωγάσης, Mtz, προκαλέσαμε κυτταρικό θάνατο σε μυϊκά κύτταρα και παρατηρήσαμε τη διαδικασία μέσω των αλλαγών του κυανού φθορισμού. Με σκοπό να περιορίσουμε την έκφραση του διαγονιδίου cfp-ntr επάγοντας NTR+ κυτταρικών κλώνων στο υπο-μελέτη ιστό, ελέγξαμε δύο συστήματα ανασυνδυασμού (Cre/loxN και Flp/FRT) στο Parhyale. Το σύστημα ανασυνδυασμού FRT/Flp επιλέγηκε και ακολούθησαν πειράματα μοριακής βιολογίας για τη κατασκευή πλασμιδιακών κατασκευών με απώτερο σκοπό τη δημιουργία διαγονιδιακών σειρών. Εφαρμόζοντας το σύστημα κυτταρικού θανάτου σε NTR+ κυτταρικούς πληθυσμούς και με τη χρήση μικροσκοπίας φθορισμού (time-lapse imaging), θα μελετήσουμε την διαδικασία της αναγέννησης των άκρων μετά από θανάτωση του εκάστοτε κυτταρικού τύπου με στόχο το προσδιορισμό του ρόλου διαφορετικών κυτταρικών τύπων στην αναγέννηση. (EL)
Conditional targeted cell ablation is a powerful tool for determining the role of specific cell types in development and regeneration. A recently established chemical-genetic system based on the bacterial E.coli enzyme nitroreductase (NTR) is efficient for conditional cell ablation. NTR reduces the drug-substrate Metronidazole (Mtz) and converts it into a cytotoxic DNA-cross linking metabolite resulting in cell death. The NTR/Mtz cell ablation system was previously shown to function in zebrafish and mice, indicating that it is likely to be an effective tool in a wide range of animals. Ι established this system¬¬¬ in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis, which is an attractive model for studying regeneration, with a range of genetic tools based on transgenesis. Using a cell type specific promoter upstream of cfp-ntr gene (NTR fused to the Cyan Fluorescent Protein) and inserting it into Parhyale genome via Minos transposable element, I achieved to express the fused protein in specific cells and visualize its expression in the transgenic animals by the presence of CFP fluorescent marker. At low concentrations of Mtz substrate (which are otherwise harmless), I could ablate muscle cells and monitor the process through changes in CFP fluorescence. I tested FRT/Flipase (Flp) and Cre/lox recombination system in Parhyale by an excision assay. Such recombinase system will enable us to restrict NTR expression within clones of cells in specific cell types or tissues. By combining nitroreductase-mediated ablation and time-lapse imaging, we will be able to monitor regenerating legs after the ablation of specific cell types (e.g. muscle or neural cells) to determine their role in limb regeneration. (EN)

text

Πανεπιστήμιο Κρήτης (EL)
University of Crete (EN)

2012-11-16




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.