Functional validation of the contribution of two sodium channel target site mutations in sodium channel blocker insecticides resistance by CRISPR-Cas9 genome modification in Drosophila melanogaster

Λειτουργική ανάλυση της συνεισφοράς της ανθεκτικότητας δύο μεταλλαγών του τασεοευαίσθητου καναλιού νατρίου ενάντια στα εντομοκτόνα indoxacarb και metaflumizone με τη χρήση της τεχνική CRISPR-Cas9 στη Drosophila melanogaster

Functional validation of the contribution of two sodium channel target site mutations in sodium channel blocker insecticides resistance by CRISPR-Cas9 genome modification in Drosophila melanogaster

Σαμαντσίδης, Γεώργιος-Ραφαήλ Κ.

Δούρης, Βασίλης

Βόντας, Ιωάννης

Δελιδάκης, Χρήστος

text

Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

2017-11-22

Η εμφάνιση του φαινομένου της ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα έχει καταστήσει προβληματική την αντιμετώπιση των πληθυσμών εντόμων που αποτελούν πλήγμα για την παγκόσμια αγροτική οικονομία καθώς και για τη δημόσια υγεία. Τα έντομα Tuta absoluta και Plutella xylostela αποτελούν είδη απειλή των αγροτικών παραγωγών και φαίνεται να αναπτύσσουν υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα, όπως είναι τα indoxacarb και metaflumizone. Μελέτες σε ανθεκτικούς σε αυτά τα εντομοκτόνα πληθυσμούς υποδεικνύουν την ύπαρξη δύο μεταλλαγών, F1845Y και V1848I (αρίθμηση με βάση την αλληλουχία του γονιδίου para του είδους P.xylostella), οι οποίες εντοπίζονται στην έκτη διαμεμβρανική περιοχή της τέταρτης υπομονάδας του καναλιού νατρίου. Η συνεισφορά των μεταλλαγών αυτών στην ανθεκτικότητα έχει πιστοποιηθεί με προσεγγίσεις in vitro. Ωστόσο μέχρι και σήμερα δεν έχουν σημειωθεί in vivo πειραματικά δεδομένα που να αναδεικνύουν τη σημασία των μεταλλαγών αυτών στην ανθεκτικότητα. Σε αυτή τη μελέτη πραγματοποιήθηκε επιτυχής εισαγωγή των μεταλλαγών αυτών στο γονίδιο του τασεοευαίσθητου καναλιού νατρίου para στο δίπτερο Drosophila melanogaster, χρησιμοποιώντας την τεχνική CRISPR-Cas9, ώστε τελικά να πραγματοποιηθεί λειτουργική ανάλυση της συνεισφοράς της ανθεκτικότητας των μεταλλαγών F1845Y και V1848I στα εντομοκτόνα indoxacarb και metaflumizone. Τα αποτελέσματα των βιοδοκιμών στα ομόζυγα για τις μεταλλαγές ανθεκτικά στελέχη των διαγονιδιακών ατόμων Drosophila κατέδειξαν ότι και οι δύο μεταλλαγές σχετίζονται με υψηλότερα επίπεδα ανθεκτικότητας έναντι του εντομοκτόνου metaflumizone (F1845Y: 3460Χ και V1848Ι: 9.9) συγκριτικά με την ανθεκτικότητα στο εντομοκτόνο indoxacarb (F1845Y: 12.5X και V1848I: 6.6X). Επιπλέον τέθηκε το ερώτημα για το ποιος είναι ο λόγος που οι δύο μεταλλαγές δεν συνεντοπίζονται στο ίδιο αλληλόμορφο (cis) στους φυσικούς πληθυσμούς των ανθεκτικτικών εντόμων. Για το λόγο αυτό δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά στελέχη εντόμων που έχουν τις δύο μεταλλαγές in cis ώστε να εξακριβωθεί εάν ο φαινότυπος είναι θνησιγόνος ή όχι. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με την ακριβή ανθεκτικότητα που προσδίδουν οι μεταλλαγές αυτές έναντι των εντομοκτόνων indoxacarb και metaflumizone σε πληθυσμούς εντόμων και επιπλέον προτείνουν ότι τα εντομοκτόνα αυτά εμφανίζουν ισχυρότερη συγγένεια πρόσδεσης με τη μεταλλαγή F1845Y παρά με τη V1848I. (EL)

Insecticide resistance emergence have rendered laborious the counteract of agricultural pests and vector borne diseases the last decades. Plutella xylostella and Tuta absoluta comprise two major agricultural pests having a tremendous potential to develop resistance against insecticides such as Sodium Channel Blocker Insecticides (SCBIs, Indoxacarb and Metaflumizone). Two amino acid alterations, F1845Y and V1848I (P.xylostella numbering), in the sixth segment of the forth domain of sodium channel have been correlated with high levels of indoxacarb and metaflumizone resistance. Although electrophysiological studies have shown the correlation of those mutations with resistance against SCBIs, no in vivo experimental data have been recorded so far. In this study we have managed to introduce F1845Y and V1848I mutations in Drosophila melanogaster sodium channel gene (paralytic), with the CRISPR-Cas9 genome editing technique, in order to investigate functionally the contribution to SCBIs resistance. F1845Y and V1848I mutations seem to confer higher resistance to metaflumizone (3460X and 9.3X respectively) than to indoxacarb (12.5X and 6.6X respectively). Moreover we had the question why F1845Y and V1848I mutations have never been found in the same allele in field populations of P.xylostella and T.absoluta. For this reason we tried to introduce both mutations in cis, in order to investigate whether the phenotype is lethal or not. These results provided useful information about the contribution of those mutations to indoxacarb and metaflumizone resistance and suggest that both indoxacarb and metaflumizone exhibit stronger binding affinity to the 1845Y than to 1848I. (EN)

Δροσόφιλα

Ανθεκτικότητα

Αγγλική γλώσσα

Πανεπιστήμιο Κρήτης

E-Locus Ιδρυματικό Καταθετήριο

Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης

Elocus