Χαρακτηρισμός Πρωτεϊνικών Αλληλεπιδράσεων και Λειτουργικός Ρόλος Της Πρωτεΐνης SH3 του Bombyx mori

 
Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :

Αποθετήριο :
Πέργαμος
δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
κοινοποιήστε το τεκμήριο



Χαρακτηρισμός Πρωτεϊνικών Αλληλεπιδράσεων και Λειτουργικός Ρόλος Της Πρωτεΐνης SH3 του Bombyx mori

Γεωργομανώλης Θεόδωρος (EL)

Η οικογένεια των πρωτεϊνών αγκυροβόλησης CAV (CAP, ArgBP2, Vinecin), που χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη τριών SH3 περιοχών στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο και μιας περιοχής με ομοιότητα με το πεπτίδιο σορβίνης (sorbin homology, SoHo) προς το αμινο-τελικό άκρο, εμπλέκεται σε σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν στη ρύθμιση των επαφών μεταξύ κυττάρων, στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και στην απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες. Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η αναγνώριση και ο χαρακτηρισμός ενός νέου μέλους της οικογένειας CAV, που εκφράζεται στον μεταξοσκώληκα Bombyx mori, την BmSH3. Η BmSH3 απομονώθηκε αρχικά ως πιθανός στόχος αλληλεπίδρασης με τον ορφανό πυρηνικό υποδοχέα BmE75C, ένα μεταγραφικό παράγοντα που εκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων και εμπλέκεται στην καταστολή της σύνθεσης της ειδικής πρωτεΐνης του αυγού (ESP, Egg Specific Protein) κατά τη μετάβαση από τη βιτελλογένεση στη χοριογένεση. Ανιχνεύτηκαν τρία μετάγραφα του γονιδίου BmSH3, τα BmSH3-A1, BmSH3-A2 και BmSH3-B. Με την μελέτη του προτύπου μεταγραφής του γονιδίου bmsh3διαπιστώθηκε η έκφρασή του σε όλους τους ιστούς του B. mori που εξετάστηκαν. Συγκεκριμένα, το μετάγραφο BmSH3-A1 ανιχνεύτηκε σε όλους τους ιστούς, που αναλύθηκαν, το BmSH3-A2 βρέθηκε στην ωοθήκη και στο κεφάλι ενώ το BmSH3-Bανιχνεύτηκε αποκλειστικά στην ωοθήκη. Ειδικά για τα μετάγραφα BmSH3-A1 και BmSH3-B,διαπιστώθηκε η συστατική συσσώρευσή τους σε όλα τα στάδια της ωογένεσης που μελετήθηκαν. Για την μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης της BmSH3 παράχθηκαν δύο αντισώματα, το anti-BmSH3.1 έναντι της περιοχής που συνδέει τη SoHo με την πρώτη SH3 περιοχή και το anti-BmSH3.2 έναντι των SH3 περιοχών. Με πειράματα τύπου Western κατέστη δυνατή η αναγνώριση πολλαπλών πιθανών ισομορφών της BmSH3 σε όλους τους ιστούς του μεταξοσκώληκα που μελετήθηκαν. Για την ειδική μελέτη της BmSH3-A1, χρησιμοποιήθηκε το anti-BmSH3.1 αντίσωμα. Πειράματα τύπου Western με τη χρήση του anti-BmSH3.1 επιβεβαίωσαν την ειδική έκφραση της BmSH3 σε εκχυλίσματα από τους ιστούς της ωοθήκης, όπου αναγνωρίστηκαν δύο ζώνες μοριακού βάρους 75 kDa και 85 kDa. Προτείνεται ότι οι ισομορφές αυτές προέρχονται από ειδική πρωτεόλυση της αυθεντικής BmSH3-A1, που αναγνωρίστηκε ακέραιη στο περίβλημα των ωοθυλακίων (sheath) μεμοριακό βάρος άνω των 120 kDa. Η κατανομή της BmSH3 σε κυτταροσειρές εντόμων προσδιορίστηκε με τη μελέτη της χιμαιρικής πρωτεΐνης EYFP-BmSH3 καθώς και της αυθεντικής BmSH3-A1, με ανοσοφθορισμό. Και στις δύο περιπτώσεις η BmSH3 βρέθηκε να έχει κυτταροπλασματική κατανομή. Μελετήθηκε επίσης η υποκυτταρική κατανομή της BmSH3-A1 σε κύτταρα εντόμων μετά από συνδιαμόλυνση με τον φορέα έκφρασης για τον παράγονταBmE75A ή τονBmE75C. Ενδιαφέρον παρουσίασε ο εντοπισμός του BmE75C: εκτός από τον αναμενόμενο πυρηνικό εντοπισμό βρέθηκε και ο έντονος κυτταροπλασματικός εντοπισμός του, με συνεντοπισμό του με την BmSH3, σε δομές των κυττάρων που μοιάζουν με ψευδοπόδια, στα φιλοπόδια και λαμελλοπόδια. Η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε και με δοκιμές ανοσοκατακρήμνισης, στην ίδια κυτταρική σειρά. Η παρατήρηση αυτή είναι σημαντική γιατί υποδεικνύει νέες λειτουργικές ιδιότητες για την BmE75C, όπως τη συμμετοχή της στην μετανάστευση των κυττάρων μέσω της αλληλεπίδρασης με την BmSH3. Επιπλέον, πιθανολογείται η εμπλοκή της στη διαφοροποίηση της λειτουργίας της BmE75C.Ο εντοπισμός του ορφανού πυρηνικού υποδοχέα BmE75C στο κυτταρόπλασμα παρουσιάζεται για πρώτη φορά καιο συνεντοπισμός του με την BmSH3 σε ειδικές δομές, όπως τα ψευδοπόδια, ανοίγει νέες προοπτικές για τους πιθανούς ρόλους του BmE75C στην οργάνωση του κυτταροσκελετού. Μεγάλο ενδιαφέρον όμως παρουσίασε και η υποκυτταρική κατανομή της BmSH3 στα θυλακοκύτταρα των ωοθυλακίων. Κατά τη βιττελλογένεση παρατηρήθηκε o κυτταροπλασματικός εντοπισμός της στα θυλακοκύτταρα. Σημαντική αλλαγή του προτύπου φθορισμού παρατηρήθηκε κατά τη χοριογένεση. Ειδικότερα κατά την πρώιμη χοριογένεση, η BmSH3 ανιχνεύτηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα των θυλακοκυττάρων, στις μεσαίες τομές αυτών και, αμυδρά, στην κορυφαία και στη βασική πλευρά και στις συνεκτικές επαφές μεταξύ των κυττάρων. Κατά την όψιμη χοριογένεση, η κατανομή της BmSH3 στα επιθηλιακά διαφοροποιείται και εμφανίζει πολικότητα. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε η απουσία της BmSH3 από τις μεσαίες τομές των κυττάρων και η συσσώρευσή της περιμεμβρανικά, στις επαφές μεταξύ των κυττάρων και στη βασική και την κορυφαία πλευρά. Επιπλέον, στην κορυφαία πλευρά των θυλακοκυττάρων η BmSH3 εντοπίστηκε σε μεγάλα κοκκία, τα οποία αντικατοπτρίζουν την δομή του σχηματιζόμενου χορίου, γεγονός που υπονοεί την εμπλοκή της BmSH3 στον μηχανισμό έκκρισης των πρωτεϊνών του χορίου. Συμπερασματικά προτείνεται ότι εκτός από τη συμμετοχή της στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, όπως συμβαίνει με όλες τις μέχρι τώρα χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες της οικογένειας CAV, η BmSH3 πιθανά εμπλέκεται και στους μηχανισμούς ανάπτυξης των ωοθυλακίων. Ειδικότερα, είναι πιθανό ότι συμμετέχει σε διαδικασίες όπως (α) το κλείσιμο των αυλακώσεων μεταξύ των θυλακοκυττάρων, που σχηματίζονται κατά το στάδιο της βιτελλογένεσης κατά τη μετάβαση από τη βιτελλογένεση στη χοριογένεση με την συμμετοχή της στον σχηματισμό συνεκτικών επιφανειών μεταξύ των θυλακοκυττάρων και (β) στο μηχανισμό έκκρισης των πρωτεϊνών του χορίου. (EL)
Members of the adaptor protein family CAV(CAP, ArgBP2, Vinecin), which is characterized by thepresence of three SH3 domains at the C-terminal and a SoHo domain at the N-terminal of its members are known to participate in various signaling pathways that lead to cytoskeletal reorganization or growth hormone responses. In this study, we present the identification of BmSH3, a new member of the CAV family found in the domesticated silkmothBombyx mori. BmSH3 was initially identified as a protein interacting with the orphan nuclear receptor BmE75C, a known transcription factor found to be expressed in the epithelium of the silkmoth ovarian follicles and known to repress the expression of the gene encoding the egg specific protein (ESP) during the transition from vitellogenesis to choriogenesis. Three putative transcripts originating from a single bmsh3 gene have been identified, BmSH3-A1, BmSH3-A2 and BmSH3-B. We studied the transcription pattern of BmSH3 and deduced the presence of BmSH3 mRNA in all studied tissues. In particular, for the three identified transcripts we found that BmSH3-A1 is expressed in all studied tissues, BmSH3-A2 is expressed in the ovary and the head, whereas transcripts of BmSH3-B were identified only in the ovary. The expression of BmSH3-A1 and BmSH3-B transcripts occurred in all stages of oogenesis. To study BmSH3 at the protein level, we generated two antibodies, anti-BmSH3.1 that recognizes the linker area between the SoHo and the first SH3 domain and BmSH3.2 that recognizes the SH3 domains. Using Western immunobloting, multiple possible protein isoforms were detected in various silkworm tissues. For the specific identification of BmSH3, we used mainly the anti-BmSH3.1 antibody, based on its specificity for the follicles. The expression of BmSH3 was verified also by Western immunoblotting of follicular tissue, where two distinct isoforms were detected of approximately 75 and 85 kDa,which we propose to be specific proteolytic cleavage products of the original BmSH3-A1 isoform, that was identified intact in the sheath. The subcellular distribution BmSH3 was investigated by transient expression of EYFP-BmSH3-A1 chimeric proteins in silkmoth cultured cells and examination of the subcellular distribution of BmSH3 in developing follicles. Following the establishment of the cytoplasmic distribution of BmSH3-A1 by immunofluorescence in transiently transfected cell lines, we examined the localization in cell lines co-transfected with BmSH3-A1 and expression vectors for BmE75A or BmE75C. Although the subcellular localization of BmSH3-A1 remained cytoplasmic, a clear change was established in the distribution of BmE75C, which in addition to the nucleus, was also found in the cytoplasm and more specifically in filopodia and lamellopodia formations. The colocalization of BmSH3-A1 with BmE75C was verified by immunoprecipitation assays. We confirmed the interaction of BmSH3-A1with BmE75C in insect cell limes co-transfected with respective expression constructs. In the same assays, after the co-transfection of the same insect cell lines with vectors expressing BmSH3-A1 and BmE75A, we could observe the interaction of these two proteins as well. This observation is significant because it implies new functions for BmE75C and BmE75A. Specifically, for the BmE75C isoform we speculate, based on its subcellular distribution, that is also involved in cell movement via the BmSH3-A1 interaction. Hence, BmSH3 could modify the known role of BmE75C and BmE75A as transcription factors to other functions. A cytoplasmic distribution of BmSH3 as represented by BmSH3-A1, was also found to exist in developing follicles, both during vitellogenesis and choriogenesis. Of particular interest was the investigation of the spatial distribution of BmSH3-A1 during choriogenesis, which revealed a dynamic change in subcellular distribution that progressed from a diffuse cytoplasmic occurance in the middle sections of the cells of the follicular epithelium during early choriogenesis, to a polarized distribution at the apical and basal sites of the follicular epithelium during late choriogenesis. At the apical site of the follicular cells of late choriogenic follicles, BmSH3 was observed at specific foci that may reflect the emerging structure of the developing chorion. Because of this distribution, we propose that BmSH3 is also involved in the mechanism of chorion protein secretion during eggshell formation. Apart from the cytoplasmic distribution of BmSH3 at the middle sections of the follicular cells during early choriogenesis, BmSH3 was also faintly observed at the apical site of newly formed cell-cell adhesions, which appear as thick polygonal shapes during late choriogenesis. Based on such observations, we also propose that BmSH3 plays a role in the loss of patency during the transition from vitellogenesis to choriogenesis. (EN)

born_digital_thesis
Διδακτορική Διατριβή (EL)
Doctoral Dissertation (EN)


Ελληνική γλώσσα

2012




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.