Εισαγωγή
Οι εξελίξεις στη γενομική και ο διαρκώς αυξανόμενος όγκος δεδομένων από τα
προγράμματα ανάλυσης του γονιδιώματος, δημιουργούν την ανάγκη για την ανάπτυξη
νέων μεθοδολογιών για την μοριακή μελέτη των γονιδίων που εμπλέκονται στην
εμφάνιση νοσημάτων. Ο σκοπός αυτής της διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη
και η προτυποποίηση μεθοδολογίας υψηλής τεχνολογίας για την ανίχνευση
μεταλλάξεων και πολυμορφισμών στο επίπεδο του DNA. Επίσης λαμβάνοντας υπ’ όψιν
τους γρήγορους ρυθμούς στους οποίους πρέπει να λειτουργεί ένα διαγνωστικό
εργαστήριο, σκοπός αυτής της μελέτης ήταν και η ανάδειξη ενός αξιόπιστου
αλγόριθμου με τον οποίο θα γίνεται η αξιολόγηση των αλλαγών που ανιχνεύονται
για πρώτη φορά και το αντίκτυπο τους στην παραγόμενη πρωτεΐνη.
Μέθοδοι
Χρησιμοποιώντας σαν μοντέλα δυο αυτοσωμικά υπολειπόμενα νοσήματα (κυστική ίνωση
και Νόσος Wilson) σχεδιάστηκαν τρία διαφορετικά πρωτόκολλα για τις πλατφόρμες
NanoChip400TM, Luminex xMAPTM και LightScanner. Η αρχή λειτουργίας της
πλατφόρμας ΝanoChip400TM βασίζεται στον ηλεκτρονικό χειρισμό ηλεκτρικού πεδίου
και αποτελεί ένα σύστημα ηλεκτρονικών μικροσυστοιχειών. Ο σχεδιασμός έγινε για
το γονίδιο ATP7B. H αρχή λειτουργίας της πλατφόρμας Luminex xMAPTM είναι η
κυτταρομετρία ροής και αποτελεί ένα σύστημα συστοιχιών με μικροσφαιρίδια. Ο
σχεδιασμός έγινε για τα γονίδια CFTR και ATP7B. Η αρχή λειτουργίας της
πλατφόρμας LightScanner είναι η αποδιάταξη του DNA με θέρμανση και αποτελεί ένα
σύστημα ανάλυσης αποδιάταξης υψηλής ευκρίνειας. Ο σχεδιασμός έγινε για τα
γονίδια CFTR και ATP7B.
Αποτελέσματα
Με τη πλατφόρμα NanoChip400TM ελέχθησαν 144 δείγματα νεογνών από την Κάλυμνο
και την Κρήτη και ανιχνεύθηκαν 14 ετεροζυγώτες για την μετάλλαξη p.His1069Gln
(6 με καταγωγή την Κάλυμνο και 8 με καταγωγή την Κρήτη), 2 ετεροζυγώτες για την
μετάλλαξη p.Arg969Gln (με καταγωγή την Κρήτη) και 2 προσυμπτωματικοί ασθενείς
με γονότυπο p.[His1069Gln] + [His1069Gln] (ομοζυγώτες για την μετάλλαξη με
καταγωγή τη Κάλυμνο).
Με τη πλατφόρμα Luminex xMAPΤΜ έγινε προσπάθεια ανίχνευσης των 50 συχνότερων
μεταλλάξεων στο γονίδιο CFTR. Παρ’ όλες τις τροποποιήσεις δεν ήταν δυνατό να
επιτύχουμε αποδεκτές τιμές για όλες τις μεταλλάξεις. Το ουσιαστικό αποτέλεσμα
όμως ήταν πως ο σχεδιασμός που είχε γίνει ήταν σωστός και γι’ αυτό τον λόγο
χρησιμοποιήθηκε, εν μέρει από την εταιρία Luminex® για το kit xTAG Cystic
Fibrosis 71 kit v2 το οποίο κυκλοφόρησε στην αγορά τον Ιούνιο 2009. Για το
γονίδιο ATP7B, ο σχεδιασμός αποδείχθηκε σωστός και επετεύχθη γονοτύπιση των 100
δειγμάτων που αναλύθηκαν για τις 26 συχνότερες μεταλλάξεις.
Με τη πλατφόρμα LightScanner στη φάση της πρωτυποποίησης ελέγχθηκαν 100
δείγματα με γνωστούς γονοτύπους και 100 τυφλά δείγματα για κάθε νόσημα. Η
ευαισθησία και η ειδικότητα βάσει των πειραμάτων υπολογίστηκε στο 100%. Επίσης
πρωτυποποιήθηκε ένα πρωτόκολλο για προγεννητική και ένα για προεμφυτευτική
γενετική διάγνωση.
Συζήτηση
Ο έλεγχος που παρέχει ένα εργαστήριο γενετικής, όταν λειτουργεί ως εργαστήριο
αναφοράς για κάποιο νόσημα, θα πρέπει να ανιχνεύει το μεγαλύτερο δυνατό ποσοστό
μεταλλάξεων. Αυτή η διαπίστωση αποκτάει ιδιαίτερο νόημα όταν αναφερόμαστε σε
ένα γενετικό νόσημα με υψηλό βαθμό μοριακής ετερογένειας στον πληθυσμό ελέγχου.
Η καταλληλότερη μέθοδος, από τις τρείς διαφορετικές που αναπτύχθηκαν στα
πλαίσια αυτής της διατριβής, είναι η υψηλής ευκρίνειας ανάλυση αποδιάταξης
καθώς μπορεί να εφαρμοστεί χωρίς να χρειάζεται πρότερη γνώση της γενετικής
σύστασης του πληθυσμού ελέγχου και με υψηλή αξιοπιστία να επιτύχουμε το
υψηλότερο δυνατό ποσοστό ανίχνευσης.
(EL)
Introduction
The progress in genome research as well as the increasing data coming from
genome wide analysis programs, dictate the need for development of novel
methodologies for molecular analysis of the genes involved in the occurrence of
disease. The aim of this PhD thesis was the design and standardization of high
throughput technology for the detection of DNA variants. Considering the quick
turnaround time of a diagnostic laboratory, another aim was the establishment
of a reliable algorithm by which all novel variants could be assessed
concerning their effect on the protein produced.
Methods
Using as disease models two autosomal recessive genetic disorders (Cystic
Fibrosis – CFTR gene and Wilson disease – ATP7B) we designed three different
protocols for the platforms NanoChip400TM, Luminex xMAPTM and LightScanner. The
principle of function for the platform ΝanoChip400TM is based on the electronic
operation of an electrical field and therefore is an electronic microarray
system. The design was for ATP7B gene. The principle of function for the
platform Luminex xMAPTM is flow cytometry and therefore is a system that
combines advanced fluidics, optics, and digital signal processing with
microsphere technology. The design was for CFTR and ATP7B genes. The principle
of function for the LightScanner platform is the DNA melting due to heating and
therefore is a system able to perform High Resolution Melting Analysis. The
design was for CFTR and ATP7B genes.
Results
Using the NanoChip400TM we analysed 144 neonatal samples from the island of
Kalymnos and Crete. We detected 14 healthy heterozygotes for the mutation
p.His1069Gln (6 from Kalymnos and 8 from Crete), 2 healthy heterozygotes for
the mutation p.Arg969Gln (from Kalymnos) and 2 asymptomatic patients with
genotype p.[His1069Gln] + [His1069Gln] (from Kalymnos)
Using the Luminex xMAPΤΜ we tried to detect έγινε the 50 most common mutations
of the CFTR gene in the Greek population. Despite all the modifications of the
test protocol, we failed to obtain the adequate signals for all the mutations.
For the ATP7B gene, we managed to get acceptable values for all the mutations
and to genotype correctly 100 samples for 26 mutations.
Using LightScanner, during standarization we tested sucesfully 100 known
samples and 100 blind samples for each disease. The sensitivity and specificity
was calculated at 100%. Another very important result was the standardzation of
a protocol for prenatal diagnosis and for preimplantation genetic diagnosis.
Conclusion
A reference laboratory for a genetic disease should be able to offer the
maximum possible mutation detection rate. This assumption takes a special
meaning when we are referring to a genetic disorder with a high heterogeneity
rate in the test population. Based on the above, the most suitable method out
of the three different ones developed during this PhD thesis is High Resolution
Melting analysis. This method offers high accuracy and sensitivity, can be
applied without the need for prior characterization of the test population and
can readily detect any genetic variant allowing for maximum detection rate.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
