Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο τη διερεύνηση του προφίλ
μεθυλίωσης 22 γονιδίων που σχετίζονται με την παθογένεια των ΙΦΝΕ σε ασθενείς
που πάσχουν από ΕΚ ή NC και τη σύγκρισή τους με τη μεθυλίωση των ίδιων γονιδίων
σε υγιείς μάρτυρες, τόσο σε παθολογικό ιστό εντέρου όσο και σε περιφερικό αίμα.
Απομονώθηκαν δείγματα περιφερικού αίματος και φλεγμαίνοντος εντερικού ιστού από
24 ασθενείς με ΙΦΝΕ, 12 εκ των οποίων έπασχαν από ΕΚ και 12 από NC. Ως ομάδα
ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν 12 υγιή άτομα, χωρίς ατομικό και οικογενειακό ιστορικό
παθήσεων από το πεπτικό σύστημα. Τα δείγματα υπεβλήθησαν σε ανάλυση μεθυλίωσης,
ενώ για μερικά εξ αυτών πραγματοποιήθηκε και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Η
στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με μη-παραμετρικές στατιστικές
δοκιμασίες (non-parametric statistical tests).
Αποτελέσματα
Όσον αφορά τη ΝC, ο βαθμός μεθυλίωσης των IL10RA, IL13, IL13RA1 και
IL17C στο περιφερικό αίμα δεν διαφέρει σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Στην
NC δεν ανευρέθησαν υπέρ-μεθυλιωμένα γονίδια. Μόνο τα γονίδια ATF2, CXCL5 και
IL12B παρουσιάζουν αυξημένη μεθυλίωση σε σχέση με τους μάρτυρες αλλά δεν
ξεπερνούν το όριο του 20% για να θεωρηθούν υπέρ-μεθυλιωμένα. Αντίθετα, τα
γονίδια CCL25, CXCL14, CXCL3, CXCL6, IL12A, INHA, IL15, IL17RA, IL4R, IL6R,
IL6ST, FADD, GATA3, IL7, TYK2 βρέθηκαν με χαμηλότερη μεθυλίωση σε σχέση με τους
υγιείς μάρτυρες. Όσον αφορά την ΕΚ, ο βαθμός μεθυλίωσης των CXCL6 και IL13RA1
στο περιφερικό αίμα δεν διέφερε σημαντικά σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες.
Πέντε γονίδια (CXCL14, CXCL5, GATA3, IL17C και IL4R) ανευρίσκονται υπέρ-
μεθυλιωμένα στην ΕΚ σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Αν και μερικά γονίδια
παρουσιάζουν αυξημένη μεθυλίωση σε σχέση με τους μάρτυρες (IL12B, ATF2, IL6R
και IL6ST) δεν θεωρούνται υπέρ-μεθυλιωμένα καθώς δεν ξεπερνούν το όριο του 20%
για την υπέρ-μεθυλίωση. Όλα τα υπόλοιπα γονίδια (CCL25, CXCL3, FADD, IL10RA,
IL12A, IL13, IL15, IL17RA, INHA, TYK2 και IL7) βρέθηκαν με χαμηλότερη
μεθυλίωση στην ΕΚ σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Επιπλέον μερικά γονίδια
παρουσιάζουν διαφορετικό πρότυπο μεθυλίωσης μεταξύ ΕΚ και NC. Συγκεκριμένα τα
γονίδια CXCL14, CXCL5, GATA3, IL17C, IL4R και CXCL6 είναι υπέρ-μεθυλιωμένα στην
ΕΚ σε σχέση με τη NC. Αντίθετα η IL13 είναι υπέρ-μεθυλιωμένη στην NC σε σχέση
με την ΕΚ. Επίσης, με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για επτά γονίδια ( CCL25,
IL13, IL17RA, IL17A, IL12B, CXCL5, IL4R) επιβεβαιώθηκε η συσχέτιση μεταξύ υπέρ-
μεθυλίωσης και υπό-έκφρασης των γονιδίων. Τέλος, για όλα τα ανωτέρω γονίδια δεν
προέκυψε διαφορά στο προφίλ μεθυλίωσης μεταξύ εντερικού ιστού και περιφερικού
αίματος.
Συμπεράσματα
Σε αυτή τη μελέτη αναγνωρίσαμε ένα σύνολο γονιδίων που παρουσιάζει
διαφορετική μεθυλίωση μεταξύ EΚ και μαρτύρων αλλά και μεταξύ ΕΚ και NC.
Επιπλέον παρουσιάσαμε ισχυρές ενδείξεις ότι το επίπεδο μεθυλίωσης μεταξύ
εντερικού ιστού και περιφερικού αίματος βρίσκεται σε συνάφεια. Τα αποτελέσματα
αυτά δείχνουν ότι τα γονίδια αυτά παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των
ΙΦΝΕ καθώς η διαφορετική μεθυλίωση αντιστοιχεί και σε διαφορετική έκφραση του
mRNA.
(EL)
This thesis aimed to investigate the methylation profile of 22 genes associated
with the pathogenesis of IBD in patients with ulcerative colitis (UC) or Crohn’
s Disease (CD) and compare them regarding the methylation profile of the same
genes in healthy controls,from tissue and blood samples.
Isolated peripheral blood samples and inflamed intestinal tissue samples were
collected from 24 patients with IBD, 12 of them suffering from UC and 12 from
CD. The control group consisted of 12 healthy subjects without any personal and
family history of digestive diseases. The promoter methylation status of genes
involved in inflammation and autoimmunity was profiled.The microarrays were
validated with Quantitative Real-time PCR.The statistical analysis was
performed using non-parametric statistical tests (non-parametric statistical
tests).
Results
Regarding CD, the methylation status of IL10RA, IL13, IL13RA1 and IL17C
in peripheral blood samples did not differ significantly from the methylation
status of healthy controls. Only three genes – ATF2, CXCL5 and IL12B showed
higher methylation in CD compared to controls, but they did not exceed the
threshold of 20% for hypermethylation. All other genes tested appear lower
methylation than controls.
Regarding UC, methylation status of CXCL6 and IL13RA1 in peripheral blood
samples did not differ significantly from the methylation status of healthy
individuals. Five genes (CXCL14, CXCL5, GATA3, IL17C and IL4R,) were found to
be significantly hypermethylated in UC patients compared to healthy
individuals. Some genes show higher methylation than controls, but they do not
exceed 20% methylation threshold for hypermethylation. All other genes show
lower methylation in UC compared to controls.
Active cases of both CD and UC could be promptly distinguished from
healthy controls based on the signatures provided by the methylation profiles
in peripheral blood samples. Based on these results - despite the relatively
limited number of patients - it was possible to define distinct signatures for
active CD vs. active UC. Specifically, CXCL14, CXCL5, GATA3, IL17C and IL4R
genes were hyper-methylated in UC compared to CD. In addition, CXCL6 which did
not differ significantly between UC and controls appeared hyper-methylated
compared to CD; in contrast, IL13 which did not differ significantly between CD
and controls appeared hypermethylated in CD compared to UC. Moreover the
real-time quantitative PCR conducted for seven genes (CCL25, IL13, IL17RA,
IL17A, IL12B, CXCL5, and IL4R) confirmed the causal relationship between
hyper-methylation and lower expression of genes. Finally, it was confirmed that
methylation profile in intestinal tissue and peripheral blood are in
concordance.
Conclusions
In this study we have identified panels of genes that show evidence of
differential methylation between UC and controls, as well as CD and UC.
Moreover there is strong evidence that methylation level in intestinal tissue
samples is well related to methylation level in whole blood samples. Our
findings suggest that these genes play an important role in IBD pathogenesis,
as differential methylation status observed affects gene expression at the mRNA
level.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
