O ρόλος του CRH στην in vitro ανάπτυξη αρχέγονων ωοθυλακίων και η δράση αυτού στην εμφύτευση

Το τεκμήριο παρέχεται από τον φορέα :
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών   

Αποθετήριο :
Πέργαμος   

δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου
στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*



O ρόλος του CRH στην in vitro ανάπτυξη αρχέγονων ωοθυλακίων και η δράση αυτού στην εμφύτευση

Ντινοπούλου Βασιλική (EL)

born_digital_thesis
Διδακτορική Διατριβή (EL)
Doctoral Dissertation (EN)

2015


Εισαγωγή: Η ορμόνη CRH είναι ένα νευροπεπτίδιο που αποτελεί το βασικό ρυθμιστή του άξονα HPA. Εντοπίζεται στους περισσότερους γυναικείους αναπαραγωγικούς ιστούς και αλληλεπιδρά με δύο υποδοχείς: CRH-R1&CRH-R2. Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν να ερευνήσει το ρόλο της CRH στην in vitro ωρίμανση προκοιλοτικών ωοθυλακίων ποντικού, στην πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη αλλά και στη στεροειδογένεση, στην παραγωγή γλυκοπρωτεϊνικών ορμονών και μιας πεπτιδικής ορμόνης. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε Real-Time PCR για τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τον CRH-R1 και τον CRH-R2 στα προκοιλοτικά ωοθυλάκια ποντικού και στα έμβρυα ποντικού σταδίου 2,4- και 8-κυττάρων και μείγμα μοριδίων-βλαστοκύστεων. Στην παρούσα μελέτη επιλέξαμε να αξιολογήσουμε επίσης την επίδρασης της CRH στην εμφύτευση, σε συσχέτιση με την έκφραση των CRH, CRH-R1, CRH-R2 και ιντεγκρινών, σε γυναίκες που συμμετείχαν στο πρόγραμμα εξωσωματικής γονιμοποίησης και είχαν παραπάνω από δύο αποτυχημένες προσπάθειες εμφύτευσης. Υλικά και Μέθοδοι: Θηλυκά ποντίκια F1 12-14 ημερών θυσιάστηκαν, απομονώθηκαν μηχανικά τα ωοθυλάκια τα οποία καλλιεργήθηκαν για 11 ημέρες, με ή χωρίς την προσθήκη CRH σε συγκέντρωση 10-7 mol/L και με CRH 10-7 mol/L και antalarmin 10-6 mol/L. Κάθε 48 ώρες γινόταν ανανέωση του καλλιεργητικού μέσου το οποίο φυλασσόταν στην κατάψυξη για τη μετέπειτα μέτρηση οιστραδιόλης, προγεστερόνης, τεστοστερόνης, β-hCG, FSH, LH και προλακτίνης με την ανοσολογική μέθοδο της ηλεκτροχημειοφωταύγειας. Μετά από 10 ημέρες καλλιέργειας προστέθηκαν HCG EGF και την 11η ημέρα εκτιμήθηκαν τα «σύμπλοκα» ωαρίων-κοκκωδών κυττάρων και μεταφέρθηκαν έπειτα από την θυσία αρσενικών ποντικών F1 για in vitro γονιμοποίηση. Τα έμβρυα καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες με σκοπό να εκτιμηθεί η πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη. Τέλος ολικό RNA απομονώθηκε από τα προκοιλοτικά ωοθυλάκια τις ημέρες καλλιέργειας 3, 5, 7, 9 και 11 όπως επίσης και από τα εμβρυικά στάδια 2-,4- και 8-κυττάρων και μείγμα μοριδίων-βλαστοκύστεων με σκοπό να γίνει Real-Time RT-PCR για τη μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων CRH-R1 και CRH-R2. Το κλινικό πειραματικό πρωτόκολλο περιλάμβανε τρία στάδια σε αντιστοιχία τριών έμμηνων κύκλων των 7 γυναικών που συμμετείχαν στη συγκεκριμένη κλινική μελέτη. Ο πρώτος έμμηνος κύκλος ήταν φυσικός κύκλος και λειτουργούσε ως κύκλος ελέγχου για κάθε γυναίκα ξεχωριστά ενώ λαμβάνονταν δύο βιοψίες από τις γυναίκες, 5 κ 8 ημέρες μετά την hCG. Ο δεύτερος κύκλος ήταν επίσης φυσικός αλλά σε αυτόν γινόταν απομόνωση των PBMCs, επεξεργασία με CRH και hCG, έγχυση στο ενδομήτριο και λαμβάνονταν και πάλι βιοψίες. Έπειτα ακολούθησε απομόνωση γενετικού υλικού και με τη βοήθεια της Real Time PCR έγινε μελέτη της έκφρασης των CRH, CRH-R1, CRH-R2 και των ιντεγκρινών αvβ3 και ανβ5 πριν και μετά την έγχυση με CRH. Στον τρίτο κύκλο οι ασθενείς έπαιρναν τα ανάλογα φάρμακα για πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας. Ταυτόχρονα γινόταν και εδώ απομόνωση των PBMCs, επεξεργασία με CRH και hCG και έγχυση στο ενδομήτριο με τη διαφορά ότι σε αυτό τον κύκλο πραγματοποιούσαμε τελικά εμβρυομεταφορά για να αξιολογήσουμε τα ποσοστά κυήσεων. Αποτελέσματα: Καλλιεργήσαμε 732 ωοθυλάκια στην ομάδα ελέγχου, 1306 ωοθυλάκια στην ομάδα CRH 10-7 και 1202 ωοθυλάκια στην ομάδα CRH 10-7/antalarmin 10-6. Τα ποσοστά ωρίμανσης για την ομάδα ελέγχου ήταν 33,6% ενώ για την ομάδα CRH 10-7 26,18% εμφανίζοντας στατιστικά σημαντική μείωση (p<0,001). Επίσης στατιστικά σημαντική διαφορά υπήρξε μεταξύ της ομάδας ελέγχου και τη ομάδας CRH 10-7 σε όλα τα στάδια ανάπτυξης των προεμφυτευτικών εμβρύων όπως και μεταξύ της ομάδας CRH 10-7 και της ομάδας CRH 10-7/antalarmin 10-6. Η εκτίμηση του ορμονολογικού προφίλ έδειξε ότι η ομάδα CRH έχει αισθητά χαμηλότερα επίπεδα οιστραδιόλης, προγεστερόνης, τεστοστερόνης και β-χοριακής όσο αυξάνονται οι ημέρες καλλιέργειας σε σχέση με τις άλλες 2 ομάδες (p-value<0,05). Η Real-Time RT-PCR έδειξε ότι οι υποδοχείς CRH-R1, -R2 ανιχνεύονται σε όλα τα στάδια καλλιέργειας των προκοιλοτικών ωοθυλακίων ενώ σε ότι αφορά τα προεμφυτευτικά έμβρυα, μόνο στο μείγμα μοριδίων-βλαστοκύστεων ανιχνεύεται ο CRH-R1. Στο κλινικό πρωτόκολλο έγινε σύγκριση της έκφρασης των CRH, CRH-R1, CRH-R2 και ιντεγκρινών αvβ3 και ανβ5 στο ενδομήτριο πριν και μετά την έγχυση με CRH, 5 κ 8 ημέρες μετά την hCG. Παρατηρήθηκε μία τάση μείωσης της έκφρασης της CRH η οποία δεν ήταν στατιστικά σημαντική ενώ η μείωση των υποδοχέων CRH-R1, R2 ήταν στατιστικά σημαντική. Για τις ιντεγκρίνες υπήρξε μία τάση αύξησης της έκφρασης χωρίς να είναι στατιστικά σημαντική. Επίσης δεν υπήρξε στατιστική σημαντικότητα στα ποσοστά κυήσεων των γυναικών (3/7 έμειναν έγκυος, 42,9%, p> 0,05 Μc Nemar test) όταν συγκρίθηκαν με τη μη ύπαρξη κύησης στους προηγούμενους κύκλους πριν την έγχυση με CRH. Συμπεράσματα: Στην παρούσα μελέτη βρέθηκε ότι η CRH είχε αρνητική επίδραση στην ωοθυλακική ανάπτυξη και ωρίμανση όπως επίσης βρέθηκε μια στατιστικώς σημαντική διαφορά στην ανάπτυξη των προεμφυτευτικών εμβρύων. Η προσθήκη του ειδικού CRH-R1 ανταγωνιστή, ανταλαρμίνη, απέδωσε υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης σε όλα τα εμβρυικά στάδια, επιβεβαιώνοντας ότι η ανταλαρμίνη αναστρέφει την ανασταλτική δράση της CRH. Αποδείξαμε ότι η παρουσία της CRH σε μία in-vitro καλλιέργεια προκοιλοτικών ωοθυλακίων καταστέλλει τη στερεοειδογένεση ενώ ο υποδοχέας CRH-R1 ανιχνεύθηκε σε όλα τα στάδια καλλιέργειας των προκοιλοτικών ωοθυλακίων όπως και στα εμβρυικά στάδια του μοριδίου και της βλαστοκύστης. Εφόσον η CRH αποτελεί τη βασική ορμόνη του “stress”, θα μπορούσαμε χρησιμοποιώντας αυτή τη γνώση, να βελτιστοποιήσουμε την ποιότητα των ωαρίων αλλά και των πρώιμων εμβρύων κατά τη διάρκεια των τεχνικών εξωσωματικής γονιμοποίησης, ελέγχοντας τα επίπεδα “stress” των ασθενών. Επιπρόσθετα, σύμφωνα με αυτή την προκαταρτική κλινική πιλοτική μελέτη παρατηρήθηκε μία τάση αύξησης της έκφρασης των ιντεγκρινών αvβ3 και ανβ5 και μία τάση μείωσης της έκφρασης της CRH στο ενδομήτριο πριν και μετά την έγχυση με CRH. Στατιστικά σημαντική όμως υπήρξε η μείωση στην έκφραση των υποδοχέων CRH-R1 και CRH-R2. Θα πρέπει να πραγματοποιηθούν περαιτέρω έρευνες ώστε να αυξήσουμε τον αριθμό των γυναικών και να αποδείξουμε την αποτελεσματικότητα της θεραπείας με CRH σε γυναίκες με επαναλαμβανόμενες αποτυχίες εμφύτευσης. (EL)
Introduction The hormone CRH is a neuropeptide which is the main regulator of HPA axis. It is detectable in most female reproductive tissues and interacts with two receptors, the CRH-R1 and the CRH-R2. Τhe purpose of this study was to investigate the effect of hormone CRH and the inhibitor, antalarmin, in the in vitro maturation of preantral mouse follicles in early embryonic development but also in steroidogenesis, in producing glycoprotein hormones and a peptide hormone. We additionally performed Real-Time PCR to study the expression of genes encoding the CRH-R1 and CRH-R2 in preantral mouse follicles and stage mouse embryos 2-, 4- and 8-cells and mix of morulae-blastocysts. In this study we also chose to evaluate the effect of CRH in the implantation, in association with the expression of CRH, CRH-R1, CRH-R2 and integrins in women participating in the IVF program, and had more than two attempts of implantation failure. Materials and Methods Female mice F1 12-14 days were sacrificed and their follicles were mechanically isolated and cultured for 11 days with or without the addition of CRH at a concentration of 10-7 mol/L and CRH 10-7 mol/L and antalarmin 10-6 mol/ L. Every 48 hours the culture medium was renewed and was kept in the freezer for later measurement of estradiol, progesterone, testosterone, b-hCG, FSH, LH and prolactin by electrochemiluminescence immunoassay. After 10 days of culture we added hCG and EGF for ovulation. On day 11 we estimated the COCs and transferred them after we sacrificed F1 male mice for in vitro fertilization. Embryos were cultured for 5 days in Ham's F10/BSA at a ratio of 9/1 in order to assess early fetal development. Finally, total RNA was isolated from the preantral follicles in culture days 3,5,7,9 and 11 as well as embryonic stages 2, 4- and 8-cells and mix morulae-blastocysts in order to do Real-Time RT-PCR to study the expression of the CRH-R1 and CRH-R2 receptors. The clinical experimental protocol consisted of three stages to match three menstrual cycles of seven women who participated in this clinical study. The first menstrual cycle was natural cycle and was performed as the control cycle for each woman and two biopsies were taken, five and eight days after hCG. The second menstrual cycle was also natural but at this cycle we isolated the PBMCs, we treated them with CRH and hCG, we infused them intrauterine and finally endometrial biopsies were taken again. Then we isolated genetic material and by Real Time PCR we studied the expression of CRH, CRH-R1, CRH-R2 and integrins αvβ3 and αvβ5 before and after injection with CRH. In the third menstrual cycle the patients were taking the appropriate medications to stimulate ovulation. Simultaneously we isolated the PBMCs, we treated them with CRH and hCG, we infused them intrauterine with the difference that in this cycle we finally did embryo transfer to evaluate pregnancy rates. Results We cultured 732 follicles in the control group, 1306 follicles in group CRH 10-7 and 1202 follicles in group CRH 10-7/antalarmin 10-6. The maturation rates for the control group were 33.6%, while for the group CRH 10-7 26.18%, showing a statistically significant reduction (p<0.001). Also there was a statistically significant difference between the control group and the group CRH 10-7 at all stages of development of preimplantation embryos and between the CRH 10-7 group and CRH 10-7/antalarmin 10-6 group. By hormonal assessment it was found that CRH group had significantly lower levels of estradiol, progesterone, testosterone and beta-hCG as days culture increased in comparison with the other two groups which gave statistically significant differences. The Real-Time RT-PCR showed that receptors CRH-R1,-R2 were detected at all stages of preantral follicles while regarding the preimplantation embryos, only at the mix morulae-blastocysts was detected the CRH-R1. The clinical protocol was compared the expression of CRH, CRH-R1, CRH-R2 and integrins αvβ3 and αvβ5 in the endometrium before and after infusion with CRH, 5 days after hCG and 8 days after hCG. There was a tendency of reduction of CRH expression which was not statistically significant, while the reduction of the receptors CRH-R1, R2 was statistically significant. For integrins there was a trend of increased expression without being statistically significant. Also there was no statistical significance in women's pregnancy rates (3/7 were pregnant, 42,9%, p> 0,05 MC Nemar test) when compared with the non-existence of pregnancy in previous cycles before injection with CRH. Conclusions According to this study, CRH had a negative effect on follicular growth and maturation, as also it was found a statistically significant difference in the development of preimplantation embryos. The addition of specific CRH-R1 antagonist, antalarmin in in vitro cultures with CRH yielded higher survival rates in all embryonic stages, suggesting that antalarmin reverses the inhibitory effect of CRH. We have shown that the presence of CRH in a in vitro culture of preantral mouse follicles suppressed stereoeidogenesi while the CRH-R1 receptor was detected in all stages of culture of preantral follicles as in embryonic stages of morulae and blastocysts. Our results demonstrated the negative effect of CRH in the rates of early embryonic development in vitro fertilized oocytes. Since CRH is the principal hormone "stress", we could use this knowledge to optimize the quality of oocytes and early embryos during IVF techniques, controlling the levels of stress of the patients. Furthermore, according to this preliminary clinical pilot study there was a trend of increase of the expression of integrins αvβ3 and αvβ5 and a trend of decrease in CRH expression in the endometrium before and after infusion with CRH. But there was a statistically significant decrease in expression of the CRH-R1 receptors and CRH-R2. Further trials should be performed in order to increase the number of women and prove the effectiveness of treatment with CRH in women with repeated implantation failure. (EN)


Ελληνική γλώσσα

Σχολή Επιστημών Υγείας » Τμήμα Ιατρικής » Τομέας Υγείας - Μητέρας - Παιδιού
Βιβλιοθήκη και Κέντρο Πληροφόρησης » Βιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/




*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.