Ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης/ποσοτικού προσδιορισμού σημειακών μεταλλάξεων/πολυμορφισμών με μοριακές τεχνικές

Ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης/ποσοτικού προσδιορισμού σημειακών μεταλλάξεων/πολυμορφισμών με μοριακές τεχνικές

Πετροπούλου Μαργαρίτα (EL)

born_digital_thesis

Διδακτορική Διατριβή (EL)

Doctoral Dissertation (EN)

2016

Οι ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων αποτελούν δημοφιλή μέθοδο διεξαγωγής διαγνωστικών δοκιμασιών. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ποικιλίας αναλυτών όπως αντιγόνα ή αντισώματα, ενώ τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται και για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων και σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκε ταχεία και αξιόπιστη μέθοδος για την ταυτόχρονη ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών, που σχετίζονται με διάφορες ασθένειες. Χρησιμοποιήθηκε η αντίδραση επέκτασης εκκινητή για τη διάκριση των αλληλίων σε συνδυασμό με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση των προϊόντων της γονοτυπικής αντίδρασης. Η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με α και β- θαλασσαιμία, θρομβοφιλία και νόσο του Wilson. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων που προκαλούν α-θαλασσαιμία με ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας και πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη με τη μέθοδο γονοτύπησης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η μέθοδος γονοτύπησης με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων περιλαμβάνει: α) αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την ενίσχυση τμημάτων γονιδίων που περιέχουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, β) πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή παρουσία αλληλοειδικών εκκινητών (ένα ζεύγος για κάθε μετάλλαξη), biotin-dUTPs και DNA πολυμεράσης με υπολειπόμενη 3΄- 5΄ εξωνουκλεοτιδική δραστικότητα και γ) ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων με χρήση νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Για την επίτευξη του καλύτερου οπτικού διαχωρισμού των αλληλομόρφων, βελτιστοποιήθηκαν τόσο οι παράμετροι της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή όσο και οι παράμετροι της ανίχνευσης των προϊόντων με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για κάθε εφαρμογή της μεθόδου. Για την αξιολόγηση των μεθόδων πολλαπλής γονοτύπησης/ανίχνευσης μεταλλάξεων σε κάθε εφαρμογή, αναλύθηκαν κλινικά δείγματα γνωστού και άγνωστου γονότυπου και τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με μεθόδους αναφοράς. (EL)

Lateral flow assays are prefabricated strips of a carrier material containing dry reagents that are activated by applying the fluid sample. Lateral flow assays are important for diagnostic purposes and are currently used for qualitative, semiquantitative and to some extent quantitative monitoring in resource-poor or non-laboratory environments. In the present thesis, we report a rapid and reliable dry-reagent dipstick method that enables simultaneous visual detection of mutations and single-nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with various diseases. The primer extension (PEXT) reaction was used in this approach for genotyping of single-nucleotide polymorphisms. The method was applied to detect mutations associated with alpha- and beta-thalassemia, thrombophilia and Wilson's disease. In addition, high-resolution melting curve analysis (HRMA) was used for the detection of mutations causing alpha-thalassemia and the results were compared to those obtained by multi-allele dipstick assay. The procedure involves: a) Polymerase chain reaction in order to amplify fragments of the gene(s) flanking the mutations of interest, b) multiplex primer extension reaction in presence of allele-specific primers (one pair per mutation), biotin d-UTPs and DNA polymerase that lacks 3’-5’ nuclease activity and c) rapid visual detection of primer extension products by means of multiplex dry reagent dipstick assay using anti-biotin functionalized gold nanoparticles as reporters. Optimization studies of various parameters influencing the multiplex genotyping reaction as well as the performance of the visual multiplex detection system were performed in order to achieve the best optical allele discrimination. For the method evaluation, clinical samples previously characterized or with unknown genotype (blind samples), were analysed by the proposed genotyping methods and the results were found to be fully concordant with reference methods. (EN)

Ελληνική γλώσσα

Σχολή Θετικών Επιστημών » Τμήμα Χημείας » Τομέας Ι [Θεωρητική Χημεία – Φυσικοχημεία – Ανόργανη Ανάλυση – Ενόργανη Ανάλυση – Οργανολογία – Χημική Μηχανική (Εφαρμ. Φυσικοχημεία)]

Βιβλιοθήκη και Κέντρο Πληροφόρησης » Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Πέργαμος

Διδακτορική Διατριβή