Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες μεταφοράς διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη,
διαφοροποίηση και επιβίωση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Πολλές ανθρώπινες
ασθένειες έχουν συνδεθεί με δυσλειτουργία ή τροποποιημένη λειτουργία
μεμβρανικών μεταφορέων, όπως η κυστική ίνωση και η αδρενολευκοδυστροφία.
Εξαιτίας τεχνικών δυσκολιών, δεν είναι δυνατή η κρυστάλλωση και απόδοση της
τρισδιάστατης δομής όλων των πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό, μια πρώτη ιδέα για
την αναδίπλωση των διαφόρων περιοχών της πρωτεΐνης θα μπορούσε να ληφθεί μέσω
μοντέλων ομολογίας, εάν υπάρχει διαθέσιμη μια αντιπροσωπευτική κρυσταλλογραφική
δομή. Τα τελευταία χρόνια έχει κρυσταλλωθεί ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών
μεταφοράς, και μέσω αυτών έχουν δημιουργηθεί μοντέλα ομολογίας συγγενικών
πρωτεϊνών. Τέτοιο παράδειγμα αποτελούν οι μεταφορείς δευτερογενούς ενεργότητας.
Καθώς η κρυσταλλογραφία αποδίδει ένα στατικό, μόνο, στιγμιότυπο δυναμικών
πρωτεϊνικών δομών έξω από τη λιπιδική διπλοστοιβάδα, η οποία αποτελεί τη φυσική
τους τοπολογία, απαιτούνται ταυτόχρονα και άλλες βιολογικές προσεγγίσεις.
Προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι παράγοντες που καθορίζουν την εκλεκτικότητα
του υποστρώματος σε δομές με χαμηλή πρωτοταγή ομολογία, αλλά υψηλή δομική
ομοιότητα είναι επιτακτική η συνδυαστική χρήση δεδομένων κρυσταλλογραφίας καθώς
και συστηματικής μεταλλαξιγένεσης. Η τελευταία αυτή βιολογική προσέγγιση σε
συνδυασμό με την κατασκευή μοντέλου ομολογίας μπορεί να αποτελέσει μια
αποτελεσματική και αξιόπιστη προσέγγιση στη μελέτη των σχέσεων δομής-
λειτουργίας των μεταφορέων δευτερογενούς ενεργότητας. Στα πλαίσια της παρούσας
διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν με βιοφυσικές και γενετικές/μοριακές
προσεγγίσεις δύο μεταφορείς πουρινών στον πρότυπο ασκομύκητα Aspergillus
nidulans, ο UapA και ο FcyB. O UapA είναι ένας συμμεταφορέας ουρικού οξέος-
ξανθίνης/Η+ της οικογένειας NAT/NCS2, για τον οποίο υπάρχει πληθώρα δομικών και
λειτουργικών μεταλλαγών. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής
κατασκευάστηκε το μοντέλο ομολογίας του, στηριζόμενο στην δομή του UraA, την
πρώτη κρυσταλλογραφία της οικογένειας. Το μοντέλο επαληθεύτηκε με μοριακή
δυναμική (Desmond). Με υπολογισμούς άκαμπτης και εύκαμπτης πρόσδεσης υπεδείχθη
η θέση δέσμευσης του υποστρώματος στον μεταφορέα, τα αμινοξικά κατάλοιπα που
συμμετέχουν, ο μηχανισμός πρόσδεσης και η πορεία του υποστρώματος από τη θέση
δέσμευσης προς το κυτταρόπλασμα (LMCS, Glide-IFD, QSAR). Προς επαλήθευση των
υπολογισμών κατασκευάστηκαν, με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση, μεταλλαγές των
καταλοίπων που υποδείχθηκαν από τους υπολογισμούς ότι συμμετέχουν στη δέσμευση
και μεταφορά του υποστρώματος. Τα στελέχη που έφεραν τις μεταλλαγές αυτές
χαρακτηρίστηκαν πλήρως φαινοτυπικά (με δοκιμασίες ανάπτυξης σε πουρίνες ως
μοναδικές πηγές αζώτου) και βιοχημικά (με μετρήσεις πρόσληψης ραδιοσημασμένης
ξανθίνης και πειράματα ανταγωνισμού), καθώς επίσης μελετήθηκε και η
υποκυτταρική τους τοπολογία (με μικροσκοπική παρατήρηση της πρωτεΐνης
συνεζευγμένης με GFP). Η βιολογική αυτή προσέγγιση επαλήθευσε τους υπολογισμούς
πρόσδεσης και το προβλεπόμενο μοντέλο. Τέλος, κατασκευάστηκαν άλλα δύο μοντέλα
ομολογίας της οικογένειας, του μεταφορέα ξανθίνης SNBT1 (στον Rattus
novergicus) και του μεταφορέα L-ασκορβικού (στον Homo sapiens). Στα μοντέλα
αυτά με υπολογισμούς πρόσδεσης υπεδείχθη το κέντρο δέσμευσης του υποστρώματος
και συνεκρίθησαν τα κατάλοιπα που συμμετέχουν με τα αντίστοιχα του UapA.
Βρέθηκε ότι τα κατάλοιπα που συμμετέχουν είναι κοινά, υποδεικνύοντας την
εξελικτική τους σχέση. Ο FcyB είναι ένας συμμεταφορέας πουρινών/Η+ της
οικογένειας NCS1/PRT, χαρακτηρισμένος στον A. nidulans. Στα πλαίσια της
παρούσας διδακτορικής διατριβής κατασκευάστηκε το μοντέλο ομολογίας του ,
βασιζόμενο στη δομή του Mhp1 της ίδιας οικογένειας. Το μοντέλο αυτό
επιβεβαιώθηκε με υπολογισμούς μοριακής δυναμικής (Desmond). Τέλος, με
υπολογισμούς πρόσδεσης υπεδείχθη η θέση δέσμευσης των υποστρωμάτων (αδενίνη,
υποξανθίνη, γουανίνη, κυτοσίνη) στον μεταφορέα και τα εμπλεκόμενα αμινοξικά
κατάλοιπα. Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων και της συντήρησης των καταλοίπων στην
στοίχιση πρωτοταγούς αλληλουχίας προτάθηκαν μεταλλαγές για την επαλήθευση των
υπολογισμών πρόσδεσης τόσο στον FcyB, όσο και σε άλλα μέλη της οικογένειας στον
A. nidulans (FurA, FurD).
(EL)
Membrane transport proteins play a crucial role in development, differentiation
and survival of eukaryotic cells. Many human diseases have been linked to
dysfunction or modified function of membrane transporters, such as cystic
fibrosis and adrenoleukodystrophy. Due to technical difficulties, it is
possible to crystallize and yield of all the three dimensional structure of
proteins. For this reason, a first idea for the folding of the various regions
of the protein could be obtained by homology modeling, if there is provided a
representative crystallographic structure. In recent years a large number
crystallize transport proteins, and these are created by homology models
related proteins. Such an example is secondary activity transporters. As
crystallography yields a static, single, dynamic snapshot protein structure
outside of the lipid bilayer, which is the physical topology, requires time and
other biological approaches. In order to clarify the factors that determine the
selectivity of substrate structures with low primary homology but high
structural similarity is imperative that the combined use of crystallographic
data and systematic mutagenesis. The latter biological approach in conjunction
with the construction Homology modeling can be an effective and reliable
approach to the study of structure-function relationships of transporters
secondary activity. In this PhD thesis were studied by biophysical and genetic
/ molecular approaches two purine transporters in the model ascomycete
Aspergillus nidulans, UapA and FcyB. UapA is a uric acid-xanthine / H+
co-transporter of the NAT/NCS2family, for which there is a wealth of structural
and functional mutations. In this PhD thesis we constructed homology model,
relying on the structure of UraA, the first X-ray crystallography of the
family. The model was verified by molecular dynamics (Desmond). Calculations
with rigid and flexible tether suggested binding site of the carrier substrate,
amino acid residues involved, the fastening device and the path of the
substrate from the binding site to the cytoplasm (LMCS, Glide-IFD, QSAR). To
verify the calculations made by site-directed mutagenesis, mutations of
residues indicated by the calculations that are involved in binding and
transport of the substrate. The strains bearing the mutations were
characterized phenotypically completely (with growth assays in purines as sole
nitrogen sources) and biochemically (by measuring uptake of radiolabeled
xanthine and competition experiments) and also studied and their subcellular
topology (by microscopic observation of the protein-conjugated GFP). The
biological approach verified the calculations mooring and the estimated model.
Finally, two other models were constructed homology family, xanthine carrier
SNBT1 (in Rattus novergicus) and L-ascorbate carrier (in Homo sapiens). In
models with these calculations suggested the binding of the substrate binding
site and the residues were compared with the corresponding part of UapA. Found
that the residues involved are common, indicating their evolutionary
relationship. FcyB is a purine / H+ co-transporter of the NCS1/PRT family,
featured on A. nidulans. In this PhD thesis we constructed a homology model,
based on the structure of Mhp1 of the same family. This model was confirmed by
molecular dynamics calculations (Desmond). Finally, binding calculations
suggested that the binding of substrates (adenine, hypoxanthine, guanine,
cytosine) to the carrier and the affected amino acid residues. Based on these
results and maintenance of residues in primary sequence alignment proposed
changes to verify the calculations tether both FcyB, and other family members
in A. nidulans (FurA, FurD).
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
