Η γήρανση είναι μία αναπόφευκτη διαδικασία σχεδόν για όλους τους οργανισμούς. Η
εμφάνιση της σχετίζεται με τη σταδιακή συσσώρευση βλαβών κατά τη διάρκεια της
ζωής στις οποίες συμβάλλουν τόσο γενετικοί όσο και στοχαστικοί παράγοντες
(Trougakos και Gonos, 2009). Αρκετά μονοπάτια έχουν εμπλακεί στην εξέλιξη της
γήρανσης, κάποια από τα οποία είναι τα μεταβολικά μονοπάτια σηματοδότησης, το
μονοπάτι των σιρτουϊνών (sirtuins), οι επιγενετικές τροποποιήσεις, η μείωση του
μήκους των τελομερών καθώς και τα μονοπάτια απόκρισης στο στρες (Argyropoulou
et al., 2013; Lopez-Otin et al., 2013, Kenyon, 2010; Alic και Partridge,
2011).
Επίσης, κατά τη γήρανση παρατηρείται αύξηση των μη ενζυματικών τροποποιήσεων
των πρωτεϊνών, όπως για παράδειγμα οι οξειδωτικές τροποποιήσεις και οι
τροποποιήσεις των πρωτεϊνών με σάκχαρα [τα λεγόμενα τελικά προϊόντα πρωτεϊνικής
γλυκοζυλίωσης (Advanced Glycation End products)-AGEs] (Nedic et al., 2013).
Αυτές οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις οδηγούν στη δυσλειτουργία των
πρωτεϊνών με αποτέλεσμα την αύξηση της πρωτεωμικής αστάθειας που μπορεί να
οδηγήσει στην επιτάχυνση της γήρανσης, καθώς και στην εμφάνιση ασθενειών που
σχετίζονται με το γήρας.
Τα κυριότερα σηματοδοτικά μονοπάτια διατήρησης της πρωτεωμικής σταθερότητας
είναι το μονοπάτι ουβικιτίνης-πρωτεασώματος, το μονοπάτι αυτοφαγίας-λυσοσώματος
καθώς και το κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι αντι-οξειδωτικής απόκρισης Nrf2/Keap1.
To σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεάσωματος συμμετέχει στην αποικοδόμηση
ουβικιτινιωμένων φυσιολογικών πρωτεϊνών με μικρό χρόνο ημιζωής καθώς και μη
λειτουργικών πρωτεϊνών τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτοσόλιο (Trougakos et
al., 2013), καθώς και στο ενδοπλασματικό δίκτυο (Brodsky, 2012) και στο
μιτοχόνδριο (Taylor και Rutter, 2011). Επίσης φαίνεται πως «συνομιλεί» με το
μονοπάτι της αυτοφαγίας (Janen et al., 2010; Fusco et al., 2012), καθώς και με
το αντιοξειδωτικό μονοπάτι Nrf2/Keap1 (Kwak et al., 2003; Grimberg et al.,
2011), ωστόσο δεν έχει αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός.
Έχει παρατηρηθεί μείωση της ενεργότητας του πρωτεασώματος κατά την κυτταρική
και την in vivo γήρανση (Chondrogianni et al., 2003; Erickson et al., 2006;
Naidoo et al., 2008; Nuss et al., 2008; Rana et al., 2013). Επομένως, το
πρωτεάσωμα συμβάλλει στη μοριακή διαδικασία της εμφάνισης και της εξέλιξης της
γήρανσης χωρίς επίσης να είναι ξεκάθαρο πως ακριβώς συμβαίνει αυτό. Για το
σκοπό αυτό είναι σημαντικό να μελετηθούν οι μεταβολές στην ομοιοστασία του
πρωτεώματος καθώς και να αναλυθεί ο βιολογικός ρόλος των κύριων πρωτεολυτικών
συστημάτων κατά τη γήρανση. Επίσης απαιτείται να πραγματοποιηθεί μια
συστηματική ανάλυση των in vivo μοριακών μεταβολών μετά από γονιδιακή
αποσιώπηση (RNAi) των διαφόρων πρωτεασωμικών υπομονάδων. Όπως αναφέρθηκε στην
αρχή τα AGΕs και οι οξειδωμένες πρωτεΐνες αυξάνουν κατά τη γήρανση και καθώς τα
AGΕs βρίσκονται σε αρκετά τρόφιμα η μελέτη της in vivo επιδρασής τους στον
οργανισμό παρουσιάζει επίσης ιδιαίτερο ενδιαφέρον.
Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση όλων των παραπάνω ερωτημάτων in
vivo στο πειραματικό μοντέλο Drosophila melanogaster. Η Drosophila είναι
ιδανική για τέτοιου είδους μελέτες, καθώς το πρωτεάσωμα της είναι όμοιο με αυτό
των θηλαστικών, συνδυάζει τόσο μετα-μιτωτικά όσο και μιτωτικά κύτταρα, ενώ μια
σειρά από μεταβολικά μονοπάτια (συμπεριλαμβανομένου του μονοπατιού Nrf2/Keap1)
είναι παρόμοια με αυτά των θηλαστικών.
Τα ευρήματα μας έδειξαν τη δυσλειτουργία του πρωτεασώματος καθώς και τη
συσσώρευση ουβικιτινιωμένων, οξειδωμένων πρωτεϊνών, καθώς και πρωτεϊνών που
έχουν τροποποιηθεί με AGEs (Advanced Glycation End Products) σε όλους τους
σωματικούς ιστούς των εντόμων κατά την in vivo γήρανση. Επίσης, βρέθηκε ότι οι
ωοθήκες και σπερματοθήκες των εντόμων είναι πιο ανθεκτικές σε σχέση με το
σωματικό ιστό τόσο στις βλάβες που υπόκειται ο οργανισμός κατά την in vivo
γήρανση όσο και στο εξωγενές οξειδωτικό στρες, αλλά και ενδεχομένως στη μερική
αναστολή του πρωτεασώματος.
Καθώς προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η καταστολή της έκφρασης βασικών
πρωτεασωμικών υπομονάδων διαταράσσει την αυτοσυγκρότηση του πρωτεασώματος
(Covi et al., 1999) και (όπως διαπιστώθηκε και στη παρούσα μελέτη) οδηγεί σε
θνησιμότητα σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια αναπτύχθηκε ένα φαρμακολογικό μοντέλο
όπου οι μοριακές αλλαγές λόγω υπο-λειτουργίας του πρωτεασώματος μελετήθηκαν
μετά από χορήγηση ειδικών πρωτεασωμικών αναστολέων. Παρατηρήθηκε ότι η μείωση
της ενεργότητας του πρωτεασώματος στα νεαρά έντομα στα επίπεδα που
παρατηρούνται σε γηρασμένα άτομα προκαλεί διαταραχή της πρωτεόστασης, μείωση
της μυϊκής δύναμης των εντόμων και τελικά τη δοσο- εξαρτώμενη μείωση του
προσδόκιμου ζωής. Επίσης η μερική αναστολή της πρωτεασωμικής ενεργότητας σε
νεαρά έντομα οδήγησε στην δοσο- εξαρτώμενη επαγωγή της γονιδιακής και
πρωτεϊνικής έκφρασης του πρωτεασώματος, καθώς και των αυτοσυγκροτημένων
πρωτεασωμάτων. Η επαγωγή της έκφρασης του πρωτεασώματος στους σωματικούς ιστούς
δεν παρατηρήθηκε, όταν γηρασμένα έντομα εκτέθηκαν στους πρωτεασωμικούς
αναστολείς σε αντίθεση με τις ωοθήκες και σπερματοθήκες που διατήρησαν την
ικανότητα επαγωγής της έκφρασης του πρωτεασώματος τόσο κατά τη γήρανση όσο και
μετά από δυσλειτουργία του πρωτεασώματος. Ακόμα, βρέθηκε ότι η δυσλειτουργία
του πρωτεασώματος οδηγεί σε αύξηση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου (Reactive
Oxygen Species-ROS) και του Η2Ο2 στα νεαρά και όχι στα γηρασμένα έντομα, καθώς
και ότι η παραγωγή ROS σηματοδοτεί την επαγωγή της έκφρασης του πρωτεασώματος.
Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε ότι η πρωτεασωμική δυσλειτουργία προκαλεί διαταραχή
της ομοιοστασίας των μιτοχονδρίων, δυσλειτουργία της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης,
καθώς και του μιτοχονδριακού συμπλέγματος ΙΙ/ΙΙΙ, γεγονός που συνάδει με την
παρατηρούμενη αύξηση των ROS.
Επίσης με τη χρήση διαγονιδιακών εντόμων διαπιστώθηκε ότι η πρωτεασωμική
δυσλειτουργία επάγει την αντιοξειδωτική άμυνα του κυττάρου στους σωματικούς
ιστούς των νεαρών εντόμων αλλά όχι στους γηρασμένους ενώ στις γονάδες
παρατηρήθηκε επαγωγή των αντιοξειδωτικών μονοπατιών ανεξαρτήτως ηλικίας. Καθώς
το κύριο μονοπάτι αντιοξειδωτικής απόκρισης είναι το μονοπάτι Nrf2/Keap1
(Sykiotis και Bohmann, 2010), ελέγξαμε αν σχετίζεται με την επαγωγή του
πρωτεασώματος μετά από πρωτεασωμική δυσλειτουργία. Η μελέτη μας έδειξε ότι η
επαγωγή του πρωτεασώματος μετά από πρωτεασωμική δυσλειτουργία σε νεαρά έντομα
διαμεσολαβείται από τον μεταγραφικό παράγοντα Nrf2 (CncC) στη Drosophila.
Ακόμη, η παροδική υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα CncC σε νεαρά αλλά και
σε γηρασμένα έντομα οδηγήσε στην αύξηση της έκφρασης και ενεργότητας του
πρωτεασώματος καθώς και σε αυξημένη ανθεκτικότητα σε σύντομο πρωτεοτοξικό
στρες. Βρέθηκε επίσης ότι η μακροχρόνια ενεργοποίηση του Nrf2 οδηγεί σε μείωση
του προσδόκιμου ζωής. Η παρατήρηση αυτή δεικνύει ότι η παρατεταμένη
ενεργοποίηση της αντιοξειδωτικής απόκρισης είναι επιβλαβής για τον οργανισμό.
Επομένως, φαίνεται πως μόνο η ήπια παροδική ενεργοποίηση των συστημάτων
διατήρησης της πρωτεόστασης είναι ωφέλιμη για τον οργανισμό.
Στη συνέχεια μελετήθηκαν διαγονιδιακά έντομα που είχαν κατασταλμένη την έκφραση
των πρωτεασωμικών υπομονάδων β1, β5, α4, α7, Rpn11, Rpn6, Rpn10 και Rpt6. Το
εύρημα ότι η μείωση της έκφρασης των υπομονάδων β5, α7, Rpn11 και Rpn6 προκαλεί
θνησιμότητα στο στάδιο της λάρβας–προνύμφης, καθώς και επαγωγή της έκφρασης των
υπόλοιπων πρωτεασωμικών υπομονάδων επιβεβαίωσε τις φαινοτυπικές μεταβολές που
παρατηρήθηκαν μετά από επίδραση σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια με τον
πρωτεασωμικό αναστολέα PS-341. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης το εύρημα ότι η
καταστολή των υπομονάδων α4, β1, Rpn10 και Rpt6 επιτρέπουν τη εκκόλαψη του
ενήλικου εντόμου, αλλά όταν τα ενήλικα έντομα μεταφέρθηκαν σε συνθήκες επαγωγής
του διαγονιδίου εμφάνισαν μείωση του προσδόκιμου ζωής με εντονότερο φαινότυπο
πρώιμης γήρανσης σε συνθήκες καταστολής της πρωτεασωμικής υπομονάδας Rpt6. Το
αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι η απουσία των υπομονάδων αυτών επιτρέπει την
συντήρηση της πρωτεασωμικής λειτουργίας ή ότι η απουσία τους εξισορροπείται από
άλλες υπομονάδες/πρωτεΐνες. Για παράδειγμα, το εύρημα ότι η καταστολή της α4
υπομονάδας δεν προκαλεί ραγδαία αύξηση της θνησιμότητας πιθανώς να εξηγείται
από το εύρημα ότι η α4 και η α3 υπομονάδες φαίνεται να έχουν παρόμοια
λειτουργία (Velichutina et al., 2004).
Όπως αναφέρθηκε, οι in vivo επιδράσεις των μη ενζυματικά τροποποιημένων
πρωτεϊνών AGEs ή της λιποφουσκίνης στη φυσιολογία του οργανισμού παρέμεναν
άγνωστες. Η διατροφή στις δυτικές χώρες είναι αρκετά πλούσια σε AGEs, τα οποία
σε μεγάλες συγκεντρώσεις συμβάλλουν στην αύξηση του οξειδωτικού στρες, καθώς
και σε φλεγμονώδεις καταστάσεις (Uribarri et al., 2010). Παρομοίως, τόσο η in
vivo όσο και η κυτταρική γήρανση συνοδεύονται από την ενδοκυτταρική συσσώρευση
της λιποφουσκίνης στα λυσοσώματα (Sitte et al., 2001; Hohn et al., 2012). Σε
συμφωνία με τα παραπάνω οι μελέτες μας έδειξαν ότι η κατανάλωση τροφής πλούσια
σε AGEs ή λιποφουσκίνη οδήγησε σε διαταραχή της πρωτεόστασης και δυσλειτουργία
του πρωτεασώματος, καθώς και αύξηση του οξειδωτικού στρες. Επιπλέον
παρατηρήθηκε αύξηση της ενεργότητας των λυσοσωμικών καθεψινών, ενώ όταν
εκτέθηκαν διαγονιδιακά έντομα που είχαν κατασταλμένη μέσω RNAi την ενεργότητα
των καθεψινών σε τροφή πλούσια σε AGEs και σε λιποφουσκίνη εμφάνισαν εντονότερο
ρυθμό θνησιμότητας. Η παρατήρηση αυτή δεικνύει ότι οι λυσοσωμικές καθεψίνες
έχουν κομβικό ρόλο στην αποικοδόμηση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων.
Συνοπτικά, τα ευρήματα μας υποστηρίζουν με πειραματικά ευρήματα την εξελικτική
θεωρία του φθαρτού σώματος (Disposable soma theory; Kirkwood, 1977), σύμφωνα με
την οποία το σώμα είναι απαραίτητο μόνο για να διατηρεί ασφαλές το
αναπαραγωγικό σύστημα το οποίο γηράσκει με σχετικά αργούς ρυθμούς. Επίσης, για
πρώτη φορά δείξαμε in vivo ότι τόσο η διαφορική ρύθμιση του πρωτεασώματος κατά
τη γήρανση όσο και η ιστοειδική ρύθμιση του πρωτεασώματος υπό συνθήκες
μειωμένης ενζυμικής ενεργότητας εξαρτώνται από το μονοπάτι σηματοδότησης Nrf2
(CncC)/Keap1. Επιπλέον, φαίνεται να υπάρχει διαφορική βαρύτητα των
πρωτεασωμικών υπομονάδων όσον αφορά στην αυτοσυγκρότηση του πρωτεασώματος, την
πρωτεασωμική λειτουργία και τελικά τη διατήρηση της ομοιοδυναμικής του
κυττάρου. Τέλος, μια δίαιτα πλούσια σε AGEs και λιποφουσκίνη επιταχύνει την
εμφάνιση του γήρατος και έτσι πιθανολογούμε ότι η περιορισμένη κατανάλωση
τροφών πλούσιων σε AGEs ή λιποφουσκίνη μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του
προσδόκιμου ζωής και/ή σε επιβράδυνση της εμφάνισης των ασθενειών του γήρατος.
(EL)
Organismal ageing is a multifactorial process modulated by the interplay
between genetic and environmental factors, and it affects most, if not all,
tissues and organs of the body (Kirkwood, 2005; Kourtis and Tavernarakis,
2011). At the tissue level, ageing-related damage of biomolecules affects all
types of cells and the extracellular matrix. The cleareance of proteome damage
is achieved via the occurrence of a complex and highly regulated network of
effective surveillance, maintenance, and clearance systems that ensure
biomolecules’ functionality, thus preventing disruption of organism
homeostasis. Key players in preventing the breakdown of cellular proteostasis
(homeostasis of the proteome) are the molecular chaperones, the oxidized
protein repair enzymes MsrA and MsrB, the mitochondrial Lon protease, and the
two main proteolytic systems (i.e., the lysosome and the proteasome), along
with main antioxidant signaling pathway NFE2-related factor 2 (Nrf2)/Keapl
(Breusing & Grune, 2008; Sykiotis & Bohmann, 2008; Hubbard et al., 2012).
Proteasome is central to proteostasis maintenance, as it degrades both normal
and damaged proteins. Herein, we undertook a detailed analysis of proteasome
function and regulation in the in vivo setting of Drosophila melanogaster. We
report that a major hallmark of somatic tissues of ageing flies is the gradual
accumulation of ubiquitinated and carbonylated proteins; these effects
correlated with a 50% reduction of proteasome expression and catalytic
activity. In contrast, gonads of ageing flies were relatively free of proteome
oxidative damage and maintained substantial proteasome expression levels and
highly active proteasomes. Moreover, gonads of young flies were found to
possess more abundant and more active proteasomes than somatic tissues.
Exposure of flies to oxidants induced higher proteasome activities specifically
in the gonads, which were, independently of age, more resistant than soma to
oxidative challenge and, as analyses in reporter transgenic flies showed,
retained functional antioxidant responses. Finally, inducible Nrf2 activation
in transgenic flies promoted youthful proteasome expression levels in the aged
soma, suggesting that age-dependent Nrf2 dysfunction is causative to decreasing
somatic proteasome expression during ageing.
As the impact of in vivo proteasome dysfunction on the proteostasis networks
and ageing processes remain poorly understood, our study then was focused to
this issue. We found that RNAi-mediated knock down of 20S proteasome subunits
in Drosophila melanogaster resulted in larval lethality. We therefore studied
the molecular effects of proteasome dysfunction in adult flies by developing a
model of dose-dependent pharmacological proteasome inhibition. Impaired
proteasome function promoted several “old-age” phenotypes and markedly reduced
flies’ lifespan. In young somatic tissues and in gonads of all ages, loss of
proteasome activity induced higher expression levels and assembly rates of
proteasome subunits. Proteasome dysfunction was signaled to the proteostasis
network by reactive oxygen species (ROS) that originated from malfunctioning
mitochondria and triggered an Nrf2-dependent upregulation of the proteasome
subunits. RNAi-mediated Nrf2 knock down reduced proteasome activities, flies
resistance to stress, as well as longevity. Conversely, inducible activation of
Nrf2 in transgenic flies, upregulated basal proteasome expression and activity
independently of age, and conferred resistance to proteotoxic stress.
Interestingly, prolonged Nrf2 over-expression reduced longevity, indicating
that excessive activation of the proteostasis pathways can be detrimental.
We then studied transgenic flies were proteasomal subunits b1, β5, α4, α7,
Rpn11, Rpn6, Rpn10 and Rpt6 expression was suppressed by RNAi. We found that
reduced expression of the β5, α7, Rpn11 and Rpn6 subunits caused larval
lethality. Also, we noted the upregulation of proteasome subunits after
completely phenocopying the phenotypes observed with PS-341. Interestingly, the
finding that suppression of the subunits α4, β1, Rpn10 and Rpt6 allowed
hatching of the adult fly indicates that some proteasome subunits can be
substituted allow thus partial maintenance of proteasome function. For example,
the finding that the suppression of α4 subunit does not appear to cause
significant increase in mortality likely explained by a previous reports
showing that the α4 and α3 subunits have similar functions (Velichutina et al.,
2004). Nevertheless the reduced longevity of these flies clearly indicates the
absence of fully functional proteasomes.
Finally, considering that the advanced glycation end product (AGEs)-modified
proteins (a non-enzymatic glycation of free amino groups of proteins) along
with lipofuscin (a highly oxidized aggregate of covalently cross-linked
proteins, sugars and lipids) have been found to accumulate during ageing and in
several age-related diseases, we studied the impact of oral administration of
glucose (Glc)-, fructose (Frc)-, or ribose (Rib)-modified albumin or of
artificial lipofuscin (LF) in Drosophila. We report that continuous feeding of
young Drosophila flies with culture medium enriched in AGEs or in lipofuscin
resulted in reduced locomotor performance, in accelerated rates of
AGEs-modified proteins and carbonylated proteins accumulation in the somatic
tissues and the haemolymph of flies, as well as in a significant reduction of
flies healthspan and lifespan. These phenotypic effects were accompanied with
reduced proteasome peptidase activities in both the haemolymph and in somatic
tissues of flies and higher levels of oxidative stress and proteasome
expression levels; furthermore, oral administration of AGEs or lipofuscin in
flies triggered an upregulation of the lysosomal cathepsins B, L activities.
Finally, RNAi-mediated cathepsin D knockdown reduced flies longevity and
significantly augmented the deleterious effects of AGEs and lipofuscin
indicating that lysosomal cathepsins reduce the toxicity of diet-derived AGEs
or lipofuscin.
In conclusion, this work provides novel evidence supporting differential
regulation of proteostasis maintenance and proteome clearance in the young
organism, during ageing, or in response to oxidative challenge in the somatic
tissues and the gonads of Drosophila. Also, our findings support experimentally
the trade-off theories of ageing evolution, where ageing is considered a
consequence of increased energetic investment in germ line (that preserves
viability across generations) over soma (only needed to support survival of a
single generation) maintenance. Moreover, our in vivo studies add new knowledge
on the proteotoxic stress-related regulation of the proteostasis networks in
higher metazoans. Proteasome dysfunction triggers the activation of an
Nrf2-dependent tissue- and age-specific regulatory circuit aiming to adjust the
cellular proteasome activity according to temporal and/or spatial proteolytic
demands. Prolonged deregulation of this proteostasis circuit accelerates
ageing. Finally, our in vivo studies demonstrate that chronic ingestion of AGEs
or lipofuscin disrupt proteostasis and accelerate the functional decline that
occurs with normal ageing.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
