Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή εστιάζει στη μελέτη των μονοπατιών των μικρών
μορίων RNA στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori, υπό το πρίσμα των παραγόντων που
επηρεάζουν την αποδοτικότητα του RNAi μηχανισμού. Οι παράγοντες που εξετάστηκαν
αφορούσαν κυρίως στην έκφραση γονιδίων-κλειδιών του RNAi μηχανισμού και στην
ύπαρξη ιϊκής μόλυνσης (εμμένουσας ή παθογόνου), ενώ ακόμα έγιναν αναφορές στους
μηχανισμούς της ενδογενούς φυσικής ανοσίας και της ικανότητας πρόσληψης dsRNA
από το εξωκυττάριο μέσο. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψαν σημαντικά
συμπεράσματα σχετικά με την επίδραση των προαναφερθέντων παραγόντων στην
αποδοτικότητα του μηχανισμού του RNAi στο μεταξοσκώληκα.
Από τη λειτουργική ανάλυση της απόκρισης του RNAi μηχανισμού στα κύτταρα Bm5
προέκυψαν στοιχεία που συνηγορούν υπέρ της πιθανής αλληλοεπικάλυψης, υπό τις
κατάλληλες προϋποθέσεις, μονοπατιών καλά χαρακτηρισμένων σε άλλα έντομα (π.χ.
Drosophila), όπως το miRNA, το siRNA και το piRNA. Συγκεκριμένα, αναδεικνύονται
τέσσερα βασικά γονίδια που συμμετέχουν στη διαδικασία της αποσιώπησης μέσω
dsRNA στο μεταξοσκώληκα in vitro: το BmAgo1 του miRNA μονοπατιού, τα
BmDcr2/BmAgo2 του siRNA μονοπατιού και το BmAgo3 του piRNA μονοπατιού. Η
εμπλοκή των γονιδίων BmDcr2 και BmAgo2 ήταν αναμενόμενη λόγω της διαθέσιμης
βιβλιογραφίας που αφορά στη Drosophila. Ωστόσο, η ανάδειξη του BmAgo3 στην
αποσιώπηση μέσω μορίων dsRNA, και όχι ssRNA, ώθησε την παρούσα μελέτη στην
ανάγκη να αναλυθεί μεθοδικότερα ο ρόλος των δύο βασικών γονιδίων του piRNA
μονοπατιού στον B. mori.
Από τα δεδομένα που προέκυψαν, το BmAgo3 φαίνεται να εμπλέκεται σε ένα
δυναμικό δίκτυο μαζί με άλλα γονίδια (π.χ. BmAgo2, BmeIF-4E1 και BmHSP90) που
θεωρούνται σημαντικά για την εύρυθμη λειτουργία του RNAi στο μεταξοσκώληκα,
δίνοντας με αυτόν τον τρόπο περισσότερες αποδείξεις για την εν δυνάμει
συνεργατική δράση των μονοπατιών siRNA και
piRNA. Βέβαια, ενώ το γονίδιο BmAgo3 έχει ουσιαστικό ρόλο στο RNAi, η έκφρασή
του σε φυσιολογικά επίπεδα δεν είναι απαραίτητη τουλάχιστον για την επιβίωση
κυττάρων μεταξοσκώληκα όπου είναι μονίμως κατασταλμένο κατά τα 2/3 της
φυσιολογικής έκφρασής του μέσω δράσης μίας ειδικά σχεδιασμένης RNA φουρκέτας.
Στον αντίποδα, σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, το γονίδιο BmAub δε θεωρείται
σημαντικό για τη γονιδιακή αποσιώπηση μέσω RNAi, όμως πιθανώς να είναι κρίσιμο
για τη βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξοσκώληκα, καθώς ήταν ανέφικτο να
επιτευχθεί κυτταρική σειρά όπου θα ήταν μόνιμα κατασταλμένο.
Εν συνεχεία, γνωρίζοντας ότι τα κύτταρα Bm5 είναι δεκτικά στην πρόκληση
γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA έπειτα από διαμόλυνση, επιχειρήθηκε να
διερευνηθεί, επιπροσθέτως, η ικανότητα πρόσληψης dsRNA από το εξωκυττάριο
περιβάλλον διαμέσου κάποιου πιθανώς άγνωστου καναλιού μεταφοράς dsRNA, σύμφωνα
με το πρότυπο δράσης της πρωτεΐνης SID-1 στο Νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis
elegans. Ωστόσο, ορισμένα προκαταρκτικά πειράματα εμβαπτισμού κυττάρων σε μέσο
που περιείχε dsRNA δεν έδειξαν σημαντική επίδραση στην έκφραση του εκάστοτε
γονιδίου-στόχου, ενώ η έκφραση των παραγόντων BmR2D2 και BmTranslin2 δε φάνηκε
να βελτιώνει την ικανότητα πρόσληψης dsRNA από τα κύτταρα και άρα την απόδοση
της γονιδιακής αποσιώπησης έπειτα από τον εμβαπτισμό.
Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση των επιπέδων έκφρασης ορισμένων RNAi
παραγόντων του B. mori σε μία ιϊκή μόλυνση που αφορά σε κύτταρα Λεπιδοπτέρων.
Σε μία εμμένουσα μόλυνση κυττάρων μεταξοσκώληκα (Bm5) από τον RNA ιό BmMLV
δείχθηκε ότι η μόνιμη καταστολή της έκφρασης του piRNA γονιδίου BmAgo3 ευνοεί
την αύξηση των ιϊκών επιπέδων. Αντίστροφα, στην περίπτωση οξείας μόλυνσης
κυττάρων Spodoptera frugiperda (Sf21) με τον ανασυνδυασμένο DNA ιό AcMNPV-EYFP,
η ετερόλογη έκφραση των γονιδίων BmR2D2 και BmTranslin2 οδηγεί σε μείωση της
ιϊκής ανάπτυξης εντός των κυττάρων και σε ταυτόχρονη αύξηση της συγκέντρωσης
των ιϊκών σωματίων στο εξωκυττάριο μέσο. Ακόμη, είναι ενδιαφέρον ότι στα ίδια
κύτταρα η καταστολή των Ago3 και Aub μέσω ειδικών RNA φουρκετών ευνοεί την
ανάπτυξη του AcMNPV-EYFP. Συνεπώς, προκύπτει ότι ορισμένοι siRNA και piRNA
παράγοντες ελέγχουν κρίσιμες λειτουργίες που σχετίζονται με την εξέλιξη μίας
ιϊκής μόλυνσης εντός των κυττάρων των Λεπιδοπτέρων.
Με σκοπό να συσχετιστεί περαιτέρω ο RNAi μηχανισμός με τις ιϊκές μολύνσεις,
διερευνήθηκε επίσης η δυνατότητα του RNA ιού BmCPV να αυτορρυθμίζει τα επίπεδα
των γονιδίων του μέσω έκφρασης από το ίδιο το γονιδίωμά του πρόδρομων
microRNAs. Όπως έχει ήδη δειχθεί, ο συγκεκριμένος ιός εκφράζει ένα pre-miRNA
που στοχεύει στο τμήμα S10 του γονιδιώματος που κωδικοποιεί για την πολυεδρίνη,
το οποίο μπορεί να ρυθμίζει τα επίπεδα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Στην
παρούσα εργασία, ελέγχθηκε εάν η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης VP1
ρυθμίζεται από την έκφραση του pre-miRNA S1.2, όμως τα αποτελέσματα δεν
οδήγησαν σε σαφή συμπεράσματα, καθώς τα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης είτε
δεν επηρεάστηκαν, είτε αυξήθηκαν από την παρουσία του pre-miRNA S1.2.
Στη συνέχεια, η ανακάλυψη της ύπαρξης εμμένουσας μόλυνσης από τον ιό BmCPV
στην αποικία μεταξοσκωλήκων του στελέχους Daizo που διατηρείτο στο εργαστήριό
μας αξιοποιήθηκε καταλλήλως, ούτως ώστε να μελετηθεί η επίδρασή της σε μία
παθογόνο μόλυνση με τον ίδιο ιό. Η ύπαρξη εμμένουσας μόλυνσης, η οποία
προηγείται της παθογόνου, δε φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά την αντιϊκή
απόκριση κατά του BmCPV, όπως προκύπτει από τη σύγκριση με προϋπάρχουσες
σχετικές μελέτες στη βιβλιογραφία. Από τη μελέτη αυτή είδαμε ότι η μεταγραφική
απόκριση στο μεσέντερο του μεταξοσκώληκα έναντι της παθογόνου μόλυνσης με τον
BmCPV είναι μία σύνθετη διαδικασία στην οποία εμπλέκεται πλήθος διαφορετικών
μηχανισμών, μεταξύ των οποίων αυτός του RNAi (π.χ. BmDcr2, BmAgo2 και
BmeIF-4E1) και, σε μικρότερο βαθμό, ο αντίστοιχος της ενδογενούς φυσικής
ανοσίας. Άλλωστε, αναφορικά με τον RNAi μηχανισμό, στην παρούσα μελέτη, έχει
δειχθεί ότι τα γονίδια BmDcr2 και BmAgo2, υπό φυσιολογικές συνθήκες,
παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση στο μεσέντερο σε σχέση με ιστούς που δεν
αποτελούν φυσική πύλη εισόδου παθογόνων στο σώμα του ζώου, όπως είναι η
επιδερμίδα. Εκτός των προαναφερθέντων μηχανισμών, στην απόκριση έναντι του
BmCPV εμπλέκονται, επίσης, γονίδια που ελέγχουν κυτταρικές διαδικασίες όπως η
ανοσολογική απόκριση, πρωτεόλυση, απόπτωση, αποτοξίνωση, ορμονική σηματοδότηση,
έκδυση, αντιγραφή DNA και το στρες. Τέλος, η ανίχνευση ιϊκών μικρών RNAs
(vsRNAs) μεγέθους 20 νουκλεοτιδίων μέσω αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS: next
generation sequencing) αποτελεί ισχυρή απόδειξη της ενεργοποίησης του RNAi
μηχανισμού ως άμυνα κατά της ιϊκής μόλυνσης με τον BmCPV, είτε αυτή πρόκειται
για εμμένουσα, είτε για παθογόνο μορφή.Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν πιθανή
αλληλοεπικάλυψη των βασικών μονοπατιών του RNAi στο μεταξοσκώληκα in vitro,
κατά την πρόκληση γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA (miRNA, siRNA και piRNA), ή
μέσω φουρκέτας RNA (siRNA και piRNA). Επιπλέον, πέραν της εμπλοκής τους στο
μηχανισμό γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA, τα γονίδια BmDcr2 και BmAgo2 του
μονοπατιού siRNA αναδεικνύονται ως καίριοι παράγοντες για το μεσέντερο του
μεταξοσκώληκα, τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες, όσο και υπό συνθήκες ιϊκής
μόλυνσης (BmCPV). Όμως, και το γονίδιο BmAgo3 του piRNA μονοπατιού φαίνεται να
συνιστά σημαντικό παράγοντα που επηρεάζει την αποδοτικότητα του RNAi μηχανισμού
στο μεταξοσκώληκα, ενώ μπορεί επίσης μαζί με τους παράγοντες BmR2D2 και
BmTranslin2, και ενδεχομένως και τον BmAub, να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο για
την αντιϊκή απόκριση (BmMLV και AcMNPV) στα Λεπιδόπτερα. Ακόμη, η παρουσία μίας
εμμένουσας μόλυνσης δε φαίνεται να επιδρά αρνητικά στην αποδοτικότητα του RNAi
μηχανισμού (BmMLV) και στην αντιϊκή προστασία του μεταξοσκώληκα (BmCPV). Τέλος,
τα κλασσικά μονοπάτια της ενδογενούς φυσικής ανοσίας του B. mori δεν
αποκρίνονται έντονα κατά τη διάρκεια της αντιϊκής προστασίας (BmCPV), και κατά
συνέπεια δε φαίνεται να αλληλεπιδρούν σημαντικά με τον RNAi μηχανισμό, ούτως
ώστε να επηρεάζουν την αποδοτικότητά του. Ωστόσο, από την παρούσα έρευνα
αναδεικνύονται νέα γονίδια που ενδεχομένως διαθέτουν στρατηγικής σημασίας
ρόλους για την αντιϊκή απόκριση του μεταξοσκώληκα σε συνδυασμό με τη δράση του
RNAi μηχανισμού.
(EL)
The present PhD Thesis has focused on the study of the small RNA pathways in
the silkworm Bombyx mori, highlighting the factors that affect the efficiency
of the RNAi mechanism. The factors examined here, mostly, involved the
expression of key-genes belonging to the RNA machinery and the presence of a
viral infection (persistent or pathogenic), while the mechanisms of the innate
immune response and the dsRNA uptake ability from the extracellular medium were
also investigated. Analysis of the results yielded important findings and
conclusions regarding the impact of the aforementioned factors on the
efficiency of silkworm’s RNAi mechanism.
Data resulting from the functional analysis of RNAi mechanism response in Bm5
cells support a possible overlap of well-characterized pathways in other
insects (for example Drosophila), such as miRNA, siRNA and piRNA, under certain
conditions. More specifically, four basic genes that participate in the
dsRNA-mediated silencing process in the silkworm are highlighted here: BmAgo1
of the miRNA pathway, BmDcr2/BmAgo2 of the siRNA pathway and BmAgo3 of the
piRNA pathway. The implication of BmDcr2 and BmAgo2 was expected due to the
literature available in Drosophila. However, the indicated role of BmAgo3 in
gene-silencing caused by dsRNA, and not ssRNA, molecules motivated the
necessity of a systematic analysis regarding the role of the two genes in piRNA
pathway of B. mori.
Based on the acquired data, BmAgo3 seems to be implicated into a dynamic
network together with other genes (BmAgo2, BmeIF-4E1 and BmHSP90), which are
important for the effective function of RNAi in the silkworm, thus providing
more evidence on the possible synergistic action of siRNA and piRNA pathways.
Nevertheless, while BmAgo3 clearly plays a substantial role in RNAi, its
expression at normal levels is not necessary, at least for the survival of
silkworm cells, where it has been permanently suppressed by 2/3 through the
expression of a RNA hairpin. In sharp contrast, according to our results, BmAub
is not considered as important for gene-silencing through RNAi, but it could be
possibly crucial for the survival of silkworm cells, as it was impossible to
obtain a transformed cell line where this gene could be permanently
downregulated.
While being aware of the susceptibility of Bm5 cells to dsRNA-mediated gene
silencing by transfection, it was additionally attempted to investigate the
dsRNA uptake ability from the extracellular medium through a likely novel and
unknown dsRNA transfer channel, with similar mode of action to CeSID-1 protein
in the nematode C. elegans. Nevertheless, preliminary experiments of cell
soaking in a dsRNA-containing medium did not show significant impact on the
expression of each target gene, while expression of BmR2D2 and BmTranslin2
factors did not seem to improve the capacity of the cells to take up dsRNA, and
therefore the efficiency of gene-silencing following soaking.
Next, the effect of expression levels of certain RNAi factors of B. mori on
viral infections in Lepidopteran cells was examined. It was demonstrated that
under persistent infection with the RNA virus BmMLV, the permanent suppression
of the piRNA gene BmAgo3 favors the increase of viral levels. Conversely, in
case of an acute infection with the recombinant DNA virus AcMNPV-EYFP,
expression of BmR2D2 and BmTranslin2 leads to a reduction of viral growth
inside the cells, and to a concomitant increase of viral particles
concentration in the extracellular medium. Moreover, it is interesting that the
hairpin RNA-mediated suppression of Ago3 and Aub genes favors the growth of
AcMNPV-EYFP virus. Hence, it is concluded that certain siRNA and piRNA factors
control crucial functions that are related to the progress of a viral infection
in Lepidopteran cells.
To further elucidate the involvement of RNAi mechanism in viral infections, the
capability of the RNA virus BmCPV to auto-regulate its own genes’ levels by
expressing precursor microRNAs from its genome was investigated. As it was
shown, this particular virus expresses a pre-miRNA that targets the genome
segment S10 coding for polyhedrin, which is able to regulate the levels of this
specific protein (Zografidis et al., 2015). Here, it was examined whether the
expression of the recombinant protein VP1 is being controlled by the expression
of pre-miRNA S1.2. However, the results did not lead to clear conclusions, as
the protein expression levels were either unaffected, or increased due to the
presence of pre-miRNA S1.2.
Next, the discovery of persistent infection by BmCPV virus in the silkworm
colony of Daizo strain maintained in our lab was accordingly used, so as to
study its effect on a pathogenic infection with the same virus. The existence
of a persistent infection preceding the pathogenic one does not seem to
significantly affect the antiviral response against BmCPV, as it is concluded
by the comparison with already published reports in the literature. This study
revealed that the transcriptome response of the silkworm midgut against the
pathogenic infection with BmCPV is a complex process, which embraces a variety
of different mechanisms, with the RNAi mechanism being critically represented
among them (BmDcr2, BmAgo2 and BmeIF-4E1) and the innate immunity one to a
lesser extent as well. Moreover, regarding the RNAi mechanism, the present
study has shown that BmDcr2 and BmAgo2 genes under normal conditions present
elevated expression levels in the midgut, in comparison to tissues which do not
form a normal infection route for pathogens in the rest of animal’s body, such
as epidermis. Apart from the aforementioned mechanisms, the response against
BmCPV includes genes controlling cellular processes such as: immune response,
proteolysis, apoptosis, stress, detoxification, hormonal signaling, ecdysis and
DNA replication. Finally, the detection of 20 nucleotides (nt) viral small RNAs
(vsRNAs), through next generation sequencing (NGS), constitutes a strong proof
of the RNAi mechanism activation, as a defense mechanism against the viral
infection by BmCPV, irrespectively the type of infection (persistent or
pathogenic).
Our findings reveal possible overlaps of the main RNAi pathways in the silkworm
in vitro, during the gene-silencing process mediated by dsRNA (miRNA, siRNA and
piRNA), or hairpin RNA (siRNA and piRNA). Interestingly, except for their
implication in the dsRNA-mediated silencing, the genes BmDcr2 and BmAgo2 of the
siRNA pathway have proved to operate as key factors in silkworm’ s midgut, both
under normal and viral infection (BmCPV) conditions. Additionally, BmAgo3 of
the piRNA pathway is an important component affecting the efficiency of the
RNAi mechanism in the silkworm, while it can also, together with BmR2D2 and
BmTranslin2, and likely BmAub as well, play a crucial role in the antiviral
response (BmMLV and AcMNPV) in Lepidoptera. Furthermore, the presence of a
persistent infection does not seem to negatively influence the efficiency of
the RNAi mechanism (BmMLV) and the antiviral defense (BmCPV) of the silkworm.
Finally, the classical pathways of the endogenous innate immunity of B. mori do
not respond strongly during antiviral defense (BmCPV) and therefore they do not
seem to significantly interact or crosstalk with the RNAi machinery, so as to
affect its proficiency. However, the present research highlights new genes that
presumably play strategic roles in the antiviral response of the silkworm in
combination with the RNAi mechanism.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
