H νεοπλασματική εκτροπή είναι το αποτέλεσμα της διαταραχής των ρυθμιστικών
μηχανισμών που διέπουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Μεταξύ
των κακοηθειών του αιμοποιητικού ιστού, η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ)
θεωρείται νόσος-υπόδειγμα για τη μελέτη του ρόλου των διαταραχών του κυτταρικού
κύκλου και της απόπτωσης στη νεοπλασματική εκτροπή και χαρακτηρίζεται από
μεγάλη κλινική ετερογένεια παρά τον ομοιογενή κλινικό και εργαστηριακό
φαινότυπο των ασθενών κατά τη διάγνωση. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η
αλληλεπίδραση των νεοπλασματικών λεμφοκυττάρων με το μικροπεριβάλλον μέσω του Β
κυτταρικού υποδοχέα (BcR) αλλά και των υποδοχέων της έμφυτης ανοσίας (TLRs)
παίζει σημαντικό ρόλο στη νεοπλασματική εκτροπή. Τα δεδομένα ωστόσο από τη
συνδιέγερση BcR/TLR στη ΧΛΛ είναι πολύ περιορισμένα επειδή οι περισσότερες
μελέτες αφορούν μεμονωμένη in vitro διέγερση είτε του BcR είτε των TLRs. Στην
παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν: (i) τα ιδιαίτερα μοριακά
χαρακτηριστικά του BcR στη ΧΛΛ και διερευνήθηκε πιθανή συσχέτισή τους με την
κλινική επιθετικότητα της νόσου, και (ii) ο αντίκτυπος της in vitro διέγερσης
του BcR, των TLR7 και TLR9 μεμονωμένα ή σε συνδυασμό (BcR/TLR7 και BcR/TLR9)
στην επιβίωση και την απόπτωση των νεοπλασματικών κυττάρων της ΧΛΛ.
Αρχικά αναλύθηκαν οι κλωνικές αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV-IGHD-IGHJ σε 799
ασθενείς με ΧΛΛ. Οι αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ αρχικά διακρίθηκαν σε
αμετάλλακτες (Α) και μεταλλαγμένες (Μ) με όριο ομολογίας του γονιδίου IGHV με
το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο ΙGHV το 98%. Στη συνέχεια, οι
αναδιατάξεις διακρίθηκαν περαιτέρω σε διαδοχικά υποσύνολα που διέφεραν μεταξύ
τους κατά 1% ως προς την νουκλεοτιδική ταυτότητά τους με το αντίστοιχο μη
αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV και διερευνήθηκε η πιθανή προγνωστική αξία των
υποσυνόλων στο χρόνο έναρξης θεραπείας και την ολική επιβίωση των ασθενών. Τα
αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επιβεβαίωσαν προηγούμενες μελέτες αναφορικά
με την επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου και έδειξαν ότι η εισαγωγή των
μεταλλάξεων σε όλες τις υποομάδες με ομολογία <100% πραγματοποιήθηκε στα
πλαίσια του κλασσικού μηχανισμού σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης. Επιπλέον,
έδειξαν ότι το όριο 98% υπερτερεί ως προς την προγνωστική σημασία για τους
ασθενείς με ΧΛΛ.
Στη συνέχεια μελετήθηκαν τα αποτελέσματα της in vitro διέγερσης των BcR, TLR7
και TLR9 με αντι-IgM, Imiquimod και CpG, αντιστοίχως, μεμονωμένα ή σε
συνδυασμό, σε 21 ασθενείς (11 Μ-ΧΛΛ, 10 Α-ΧΛΛ). Τα αποτελέσματα της διέγερσης
εκτιμήθηκαν με προσδιορισμό της pERK, ενώ η επαγωγή της απόπτωσης με
προσδιορισμό της κασπάσης 8 και της PARP. Αυξημένα επίπεδα pΕRΚ παρατηρήθηκαν
μετά από μεμονωμένη διέγερση των BcR, TLR7 και TLR9 στην Α-ΧΛΛ, ενώ στη Μ-ΧΛΛ
μόνο με συνδιέγερση BcR/TLR. Αντίθετα, η μεμονωμένη διέγερση των TLR7 και TLR9
αλλά και η συνδιέγερση BcR/TLR βρέθηκαν να προκαλούν επαγωγή της απόπτωσης
κυρίως στη M-ΧΛΛ. Η διαφορετική ανταπόκριση των νεοπλασματικών λεμφοκυττάρων
στη Μ-ΧΛΛ έναντι της Α-ΧΛΛ πιθανότατα υποδεικνύει διαφορετικό λειτουργικό
αποτέλεσμα, που αντικατοπτρίζεται τελικά στη συμπεριφορά του λευχαιμικού κλώνου
και τροποποιεί το ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την απόπτωση.
(EL)
Deregulation of intracellular signaling events controlling proliferation and
apoptosis promotes neoplastic aberration. Chronic lymphocytic leukemia (CLL), a
malignancy of lymphoid cells, constitutes a model disease for the study of
disorders of cell cycle and apoptosis. CLL is a clinically heterogeneous
disease despite the homogenous phenotype of patients at diagnosis. Recent
studies revealed that CLL cells may also interact with their microenvironment
via receptors of both adaptive (B-cell receptor, BcR) and innate immunity (e.g.
Toll-like receptors, TLRs) and that this interaction plays a prominent role in
CLL development and evolution. Emerging data from concomitant BcR/TLR
stimulation in CLL are limited since most studies have examined the effects of
immune stimulation only after single BcR or TLR triggering. On these grounds,
we here investigated (i) the molecular features of the BcR in CLL and possible
correlations with the aggressiveness of the disease and (ii) the impact of in
vitro single (BcR, TLR7 and TLR9) or concomitant (BcR/TLR7 και BcR/TLR9)
stimulation on the proliferation and apoptosis of CLL cells. We analyzed
molecular features of productive IGHV-IGHD-IGHJ rearrangements from 799 CLL
cases. Initially, following the 98% identity cutoff value with the closest germ
line IGHV gene, sequences were subdivided into unmutated (U) and mutated (M)
categories. Sequences were further subdivided in subgroups with 1% difference
identity with germ line genes and survival curves for subgroups of patients
with varying degrees of sequence identity were prepared. In keeping with
previous studies, the IGHV gene repertoire was remarkably biased. In addition,
somatic hypermutation analysis (SHM), performed for all CLL sequences in this
cohort with less than 100% identity to germ line, showed that SHM patterns were
typical of a canonical SHM process. Furthermore, the 98% sequence identity cut
off value, although arbitrary, has the most prognostic value.
To explore whether specific types of BcR/TLR collaboration exist in CLL, we
studied the effect of single vs. concomitant BcR and/or TLR stimulation on CLL
cells from 11 M-CLL and 10 U-CLL cases stimulated with anti-IgM, Imiquimod and
CpG ODN for BcR, TLR7 and TLR9 respectively, alone or in combination. Results
were estimated by determining pERK levels while the induction of apoptosis
determining the active isoform of caspase 8 and the cleaved fragment of PARP.
Pronounced pERK induction was seen by single stimulation in U-CLL, whereas
BcR/TLR synergism was required in M-CLL. An opposite pattern was observed
regarding induction of apoptosis, with M-CLL responding even to single
stimulation, contrasting U-CLL that showed minimal response. Differential
responses of CLL cells depending on the mutational status of the BcR, probably
indicates different operating result, ultimately reflected in the behavior of
the leukemic clone and modifies the rate of cell proliferation and apoptosis.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
