Μελετήθηκε ο ρόλος τριών συντηρημένων πολικών αμινοξέων, των Glu356, Gln382 και
Lys439, του μεταφορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης UapA του Aspergillus nidulans,
ενός πρότυπου ευκαρυωτικού μικροοργανισμού. Αυτά υποκαταστάθηκαν και τα αλλήλια
μελετήθηκαν φυσιολογικά, μικροσκοπικά και κινητικά για τον καθορισμό των
αλλαγών της λειτουργίας και κινητικής τους συμπεριφοράς. Τα αποτελέσματα
έδειξαν πως το Glu356 είναι απαραίτητο για τη μεταφορά, ενώ φαίνεται να
συμμετέχει στη δέσμευση των υποστρωμάτων. Όσον αφορά τη μετα-μεταφραστική
ρύθμιση του UapA, μελετήθηκε το φαινόμενο της αρνητικής του ρύθμισης από τα
υποστρώματά του. Δείχθηκε πως ο UapA ενδοκυτώνεται από τα υποστρώματά του μέσω
διαλογής στα ενδοσώματα και τελικά αποικοδομείται στο χυμοτόπιο. Η ενδοκύτωση
από υπόστρωμα δείχθηκε να είναι ανεξάρτητη της ενδοκυτταρικής του συγκέντρωσης
αλλά απολύτως εξαρτώμενη της λειτουργίας του μεταφορέα. Το σήμα για την
ενδοκύτωση φαίνεται να προκαλείται από δυναμικές δομικές διαμορφώσεις του
μεταφορέα κατά την ολοκλήρωση του κύκλου μεταφοράς. Η ενδοκύτωση
πραγματοποιείται μέσω ουβικουτινυλίωσης του UapA στην Lys572 από την HulARsp5
λιγάση της ουβικουιτίνης. Τέλος, η ενδοκύτωση δείχθηκε να πραγματοποιείται και
in trans, αφού μόρια ανενεργά ή με αδυναμία ουβικουτινυλίωσης ενδοκυτώνονται
από υπόστρωμα όταν συνεκφράζονται με ένα ενεργό μόριο, γεγονός που υποστηρίζει
τον ολιγομερισμό του UapA.
(EL)
The role of three conserved polar residues, Glu356, Gln382 and K439, in the
translocation mechanism of the UapA uric acid transporter of Aspergillus
nidulans, a eukaryotic model system, was examined. These residues were
substituted and the mutant alleles were physiologically, microscopically and
kinetically studied. The results showed that Glu356 is necessary for transport
and seems to contribute to substrate binding. In regard to the
post-translational regulation of expression of the transporter, the phenomenon
of its down-regulation by its substrates was studied. It was shown that UapA is
endocytosed upon substrate addition, sorted to endosomes and finally degraded
in the vacuole. The substrate-induced endocytosis was shown to be independent
of its intracellular concentration, but absolutely dependent on transporter
function. The signal for the transporter’s endocytosis seems to rely on subtle
dynamic conformational changes of the transporter during the completation of
its transport cycle. Mechanistically, UapA endocytosis is achieved through
ubiquitinylation of Lys572 from the HulARsp5 ubiquitin ligase. Finally,
endocytosis can occur in trans, as non functional or non-ubiquitinylated UapA
molecules can be endocytosed when co-expressed with functional UapA molecules,
a result that suggests UapA oligomerisation.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
