Η κατάθλιψη είναι μία ψυχική διαταραχή που εμφανίζεται αρκετά συχνά και όσο και
περισσότερο στις αναπτυγμένες κοινωνίες. Με τα σύγχρονα θεραπευτικά μέσα η
κατάθλιψη είναι μια νόσος που μπορεί να αντιμετωπιστεί. Ιδιαίτερα δημοφιλή
φάρμακα είναι οι εκλεκτικοί αναστολείς επαναπρόσληψης της σεροτονίνης (SSRIs)
και οι αναστολείς επαναπρόσληψης της σεροτονίνης και της νορεπινεφρίνης (SNRIs).
Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναπτύχθηκε μία μέθοδος διαχωρισμού και
ποσοτικού προσδιορισμού της παροξετίνης, της φλουοξετίνης, της βενλαφαξίνης και
της ντουλοξετίνης. Η τεχνική, που χρησιμοποιήθηκε σε εναλλακτικά βιολογικά
υποστρώματα, ήταν η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης, με στήλη Hichrom Kromasil
100-5C18 (250 4.6 mm) 5 μm (Hichrom, Reading, Berkshire, UK). Η ροή του
συστήματος ήταν 1,3 mL/min, ενώ η πίεση δεν ξεπερνούσε τα 150 kg/cm2. Η κινητή
φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα ακετονιτριλίου και οξικού αμμωνίου (0,05 M)
σε αναλογία 41:59% v/v. Η ανίχνευση των ενώσεων και ο ποσοτικός προσδιορισμός
τους πραγματοποιήθηκε σε μήκος κύματος 235 nm με φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή
UV-Vis. Ο χρόνος, στον οποίο πραγματοποιήθηκε ο διαχωρισμός των
αντικαταθλιπτικών φαρμάκων ήταν 11 min.
Τα δύο πρώτα βιολογικά υποστρώματα που μελετήθηκαν ήταν οι ανθρώπινες τρίχες
και οι όνυχες. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε και στις δύο περιπτώσεις ήταν το
ίδιο, με μόνη διαφορά πως στους όνυχες δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός της
βενλαφαξίνης. Αρχικά, έγινε πλύση και τεμαχισμός της τρίχας και του όνυχος και
στη συνέχεια, ο εμβολιασμός των δειγμάτων με μίγμα των 4 αντικαταθλιπτικών
φαρμάκων. Την άλλη μέρα προστέθηκε μεθανόλη και αφέθηκαν τα δείγματα στο
σύστημα υπερήχων. Τα δείγματα εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού, επαναδιαλύθηκαν σε
μεθανόλη και εισήχθηκαν στην HPLC. Από τα χρωματογραφήματα και τις καμπύλες
αναφοράς υπολογίστηκαν τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης, τα οποία
βρέθηκαν να κυμαίνονται από 0,12 μέχρι 0,70 ng/mg και 0,36 μέχρι 2,12 ng/mg,
αντίστοιχα, για τις τρίχες, ενώ για τους όνυχες από 0,11 μέχρι 0,63 ng/mg και
0,34 μέχρι 1,19 ng/mg, αντίστοιχα. Έλεγχος, επίσης διεξάχθηκε για την
επαναληψιμότητα και την ακρίβεια της μεθόδου. Στις τρίχες η σχετική τυπική
απόκλιση (RSD) για τις μετρήσεις της ίδιας ημέρας κυμαίνονταν από 1,1 μέχρι
10,8 και οι ανακτήσεις μεταξύ 82,8 και 89,7%, ενώ για τις μετρήσεις που
πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια 5 ημερών 0,8 μέχρι 14,1 και 75,1 με 91,8%,
αντίστοιχα. Οι ίδιοι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν και για τους όνυχες με τα
αποτελέσματα να είναι μεταξύ του 1,1 και 10,8 για το RSD στις μετρήσεις τις
ίδιας ημέρας και οι ανακτήσεις 82,8 με 89,7%, ενώ για τις μετρήσεις που
πραγματοποιήθηκαν στη διάρκεια 5 ημερών η σχετική τυπική απόκλιση να είναι από
10,1 μέχρι 16,6 και οι ανακτήσεις από 82,1 μέχρι 119,0%.
Το τρίτο βιολογικό υπόστρωμα που μελετήθηκε ήταν το εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Το
πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε περιελάμβανε την προσθήκη μέσα σε ένα φιαλίδιο
Eppendorf εγκεφαλονωτιαίου υγρού, CH3CN και πρότυπου μίγματος των
αντικαταθλιπτικών φαρμάκων. Πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση σε vortex,
τοποθέτηση του φιαλιδίου Eppendorf στη φυγόκεντρο για 15 min στις 3500 rpm,
εξάτμιση σε ρεύμα αζώτου μέχρι ξηρού, επαναδιάλυση σε CH3OH και εισαγωγή του
στο σύστημα της HPLC. Από τα χρωματογραφήματα και τις καμπύλες αναφοράς
υπολογίστηκαν τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης, τα οποία βρέθηκαν
από 0,14 μέχρι 0,70 ng/μL και 0,41 μέχρι 2,10 ng/μL, αντίστοιχα. Έλεγχος επίσης
διεξάχθηκε για την επαναληψιμότητα και την ακρίβεια της μεθόδου με τα
αποτελέσματα για τις μετρήσεις της ίδιας ημέρας να κυμαίνονται για το RSD από
2,1 μέχρι 11,2 και για τις ανακτήσεις από 86,6 μέχρι 112,7%, ενώ για τις
μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν στη διάρκεια 5 ημερών από 6,4 μέχρι 15,9 και
83,1 με 124,3%, αντίστοιχα. Στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ελέγχθηκε επίσης και η
σταθερότητα των προσδιοριζόμενων ενώσεων με κύκλους ψύξης-απόψυξης και με
αποθήκευση σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες, -18οC, 4οC και 20οC.
Τέλος, η μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα τρίχας και ονύχων από
ασθενή ο οποίος ελάμβανε κάψουλες Dagrilan, οι οποίες περιέχουν ως δραστική
ουσία την φλουοξετίνη.
Συνοψίζοντας, λοιπόν καταλήγουμε πως η μέθοδος είναι απλή, οικονομική και
αποτελεσματική και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο εργαλείο τόσο στην
κλινική όσο και στην ιατροδικαστική τοξικολογία.
Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του Τμήματος
Χημείας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης.
(EL)
A simple HPLC method for the simultaneous determination of two selective
serotonin reuptake inhibitors (fluoxetine and paroxetine) and two
serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors (venlafaxine and duloxetine) in
alternative samples of toxicological interest: hair, nail clippings and
cerebrospinal fluid.
Depression is a very frequent mental disorder. It can be treated with a variety
of drugs such as selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) and
serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors (SNRIs).
We have currently developed a method for the separation and quantification of
paroxetine, fluoxetine, venlafaxine and duloxetine in alternative biological
matrices. We used High Pressure Liquid Chromatography with a Hichrom Kromasil
100-5C18 (250 4.6 mm) 5 mm (Hichrom, Reading, Berkshire, UK) column. The flow
rate was 1.3 mL / min and the pressure did not exceed 150 kg/cm2. The mobile
phase used was a mixture of acetonitrile and ammonium acetate (0.05 M) at a
ratio of 41:59% v/v. For the detection of compounds a UV-Vis spectrophotometric
detector was used, set at 235nm. The total analysis time was approximately 11
min.
The first two biological matrices studied were human hair and nails. The only
difference between the protocols followed in each case was that venlafaxine
could not be detected in nails. Hair and nails were initially washed and cut
and then samples were spiked with a mixture of the 4 antidepressants. The next
day, methanol was added to the samples and they were ultrasonicated. The
samples were evaporated to dryness, redissolved in methanol and introduced to
the HPLC. Limits of detection and quantitative assessment were calculated from
the chromatograms and reference curves and were found to range from 0.12 to
0.70 ng/mg and 0.36 to 2.12 ng/mg, respectively, for hair, while for nails they
ranged from 0.11 to 0.63 ng/mg and 0.34 to 1.19 ng/mg, respectively. The
repeatability and accuracy of the method were also evaluated. In hair, the
intra-day relative standard deviation (RSD) ranged from 1.1 to 10.8 and
recoveries ranged between 82.8 and 89.7%, while for the measurements obtained
during 5 days they ranged from 0.8 to 14.1 and from 75.1 to 91.8%,
respectively. In nails, intra-day RSD values were between 1.1 and 10.8 and
recoveries ranged from 82.8 to 89.7%, while for the measurements made during 5
days RSD values ranged from 10.1 to 16.6 and recoveries from 82.1 to 119.0%.
The third biological matrice studied was cerebrospinal fluid. The protocol
followed included the addition, in an Eppendorf vial, of cerebrospinal fluid,
CH3CN, and a standard mix of antidepressants. Homogenization in vortex, placing
of the vial Eppendorf in the centrifuge for 15 min at 3500 rpm, evaporation in
a stream of nitrogen to dryness, redissolution in CH3OH and introduction on the
HPLC system. Limits of detection and quantitative assessment were calculated
from the chromatograms and reference curves and were found to range from 0.14
to 0.70 ng/ml and 0.41 to 2.10 ng/ml, respectively. The repeatability and
accuracy were also evaluated. Intra-day RSD values ranged from 2.1 to 11.2 and
recoveries from 86.6 to 112.7%, while for measurements carried out during 5
days these values ranged from 6.4 to 15.9 and from 83.1 to 124.3%,
respectively. CSF was also evaluated for the stability of the compounds during
repetitive freeze-thaw cycles and storage at three different
temperatures,-18oC, 4°C and 20oC.
Finally, the method was applied to actual hair and nail samples obtained from a
patient under fluoxetine therapy.
As a conclusion, the method is simple, cheap and effective and can be used as a
reliable tool in clinical and post-mortem toxicology.
The project was conducted at the Laboratory of Analytical Chemistry, Department
of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
