Η φαινυλοκετονουρία (PKU) και η ανεπάρκεια της αφυδρογονάσης των μεσαίας
αλυσίδας ακυλοσυνενζύμων Α (MCADD) είναι δύο μεταβολικές διαταραχές με
αυτοσωμικό υπολειπόμενο χαρακτήρα, έλεγχος των οποίων περιλαμβάνεται στα
προγράμματα νεογνικού ελέγχου των περισσοτέρων Ευρωπαϊκών χωρών λόγω της
σχετικά υψηλής συχνότητας εμφάνισής τους (1:10.000-1:15.000). Η διάγνωση της
PKU πραγματοποιείται μέσω προσδιορισμού τόσο της συγκέντρωσης της
φαινυλαλανίνης (Phe) όσο και του λόγου φαινυλαλανίνης/τυροσίνη (Phe/Tyr) στο
αίμα ή τα ούρα. Από την άλλη πλευρά, οι ουσίες που αποτελούν τους κυριότερους
δείκτες για την MCADD είναι οι εξανοϋλο- (C6), η οκτανοϋλο- (C8), η δεκανοϋλο-
(C10) καρνιτίνη και δευτερευόντως ο λόγος C8 / C10, καθώς και οι λόγοι των
ακυλοκαρνιτινών με την ακετυλοκαρνιτίνη (C2) δηλαδή οι λόγοι C6 / C2, C8 / C2,
C10 / C2.
Στην εργασία αυτή παρουσιάζεται η ανάπτυξη μεθόδου υγρής χρωματογραφίας-
φασματομετρίας μαζών (HPLC-MS/MS) για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των
προαναφερόμενων ουσιών σε αποξηραμένες κηλίδες αίματος νεογνών. Η μέθοδος δεν
απαιτεί παραγωγοποίηση των δειγμάτων ούτε τη χρήση ισοτοπικά επισημασμένων
προτύπων και ο συνολικός χρόνος ανάλυσης είναι πέντε λεπτά ανά δείγμα. Ο
ποσοτικός προσδιορισμός των ουσιών πραγματοποιείται μέσω καμπύλης βαθμονόμησης
η οποία κατασκευάζεται με ανάλυση προτύπων δειγμάτων αίματος, αποξηραμένου σε
απορροφητικό χαρτί. Για την ανάπτυξη της μεθόδου προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες
συνθήκες ανίχνευσης των ουσιών με MS, οι βέλτιστοι διαλύτες εκχύλισης των
ουσιών από τις αποξηραμένες κηλίδες αίματος, και οι βέλτιστες συνθήκες για την
επίτευξη πλήρους διαχωρισμού των ουσιών μέσω HPLC. Λόγω του διαχωρισμού των
ουσιών πριν την αίχνευση τους με MS, η μέθοδος προσφέρει τη δυνατότητα
ποσοτικού προσδιορισμού που βασίζεται στο σήμα του προδρόμου ιόντος, αυξάνοντας
σημαντικά την ευαισθησία ανίχνευσης συγκριτικά με μεθόδους MS/MS στις οποίες η
ποσοστικοποίηση επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης εσωτερικών προτύπων και πρέπει να
στηρίζεται στο σήμα του θυγατρικού ιόντος εφόσον θα πρέπει να αποφευχθούν
ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω της παρουσίας ισοβαρών ουσιών ή ιόντων με το
ίδιο m/z ως προς τις προσδιοριζόμενες ουσίες.
Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από υψηλή αναλυτική ευαισθησία, ακρίβεια και
επαναληψιμότητα. Τα όρια ανίχνευσης ήταν 1,3 μmol/L για την Phe, 4,7 μmol/L για
την Tyr, 0,40 μmol/L για τη C2 και 0,006, 0,008 και 0,008 για τις C6, C8, C10,
αντίστοιχα. Οι καμπύλες βαθμονόμησης για όλες τις ουσίες ήταν γραμμικές
(r2>0,99) από 24 έως 800 μmol/L για την Phe και Tyr, από 3 έως 100 μmol/L για
την C2 και από 0,1 έως 10 μmol/L για τις C6, C8 και C10. Ο έλεγχος της
ακρίβειας πραγματοποιήθηκε μέσω πειραμάτων προσθήκης γνωστών συγκεντρώσεων των
ουσιών σε δείγματα. Η ανάκτηση κυμαινόταν από 93% έως 105%, υποδεικνύοντας την
ακρίβεια της μεθόδου. Η ενδο- και διαναλυτική διάκυμανση ήταν μικρότερες από
10% και 15%, αντίστοιχα, για όλες τις ουσίες. Η μέθοδος έχει υψηλή ειδικότητα
και δεν παρατηρήθηκαν επιδράσεις από τη βιολογική μήτρα. Τέλος, η αξιολόγηση
της μεθόδου πραγματοποιήθηκε μέσω της ανάλυσης 450 δειγμάτων νεογνών
(αποξηραμένων κηλίδων αίματος) τόσο με την αναπτυχθείσα μέθοδο όσο και με
ημιποσοτική μέθοδο που βασίζεται στη χρήση εμπορικά διαθέσιμης συσκευασίας, η
οποία περιλαμβάνει ισοτοπικά επισημασμένες ενώσεις ως εσωτερικά πρότυπα. Τα
αποτελέσματα που ελήφθησαν για τις δύο μεθόδους ήταν σε συμφωνία τόσο ως προς
τα δείγματα, των οποίων οι τιμές βρίσκονταν εντός φυσιολογικών ορίων, όσο και
ως προς μικρό αριθμό δειγμάτων των οποίων οι τιμές υπερέβαιναν τα φυσιολογικά
όρια.
Λαμβάνοντας υπόψη την εξαιρετική αναλυτική απόδοση της μεθόδου σε συνδυασμό με
το σύντομο χρόνο ανάλυσης (5 λεπτά), ο οποίος επιτρέπει την ανάλυση
περισσοτέρων των 250 δειγμάτων ανά ημέρα, η μέθοδος που αναπτύχθηκε είναι
κατάλληλη για την εφαρμογή της στον νεογνικό έλεγχο ρουτίνας της PKU και της
MCADD.
(EL)
Phenylketonouria (PKU) and medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency
(MCADD) are autosomal recessive disorders, usually included in newborn
screening of most European countries due to their high prevalence. Diagnosis of
PKU is based on determination of phenylalanine and phenylalanine to tyrosine
ratio, whereas of MCADD on determination of medium-chain acyl-carnitines
(hexanoyl-, octanoyl-, decanoyl-carnitine) and recently to their ratios with
acetyl-carnitine, in dried blood spots.
Here, we present an HPLC-MS/MS method for the simultaneous quantitative
determination of all mentioned analytes in newborn blood spots. Neither
derivatization of analytes nor addition of isotopically labeled internal
standards in the sample is required since quantitation is based on a series of
analytes calibrators in blood spots. The detection parameters of MS/MS were
optimized, while appropriate solvents and gradient were selected to achieve
separation of the analytes by HPLC prior to MS/MS analysis. The separation of
the analytes permitted quantification to be based on the precursor ion, thus
increasing detection sensitivity compared to MS/MS methods, including internal
standards, and based on the product ion signal, to overcome false positive
results, obtained due to the presence of isobaric compounds or compounds that
show the same m/z with the analytes determined.
The method developed is characterized by high analytical sensitivity, accuracy
and repeatability. Limits of detection of 1.3 and 4.7 μmol/L for Phe and Tyr,
and 0.40, 0.006, 0.008, 0.008 μmol/L for acetyl-, hexanoyl-, octanoyl-, and
decanoyl-carnitine, respectively, were achieved. The calibration curves were
linear (R2>0,99) in the range of 24 to 800 μmol/L for Phe and Tyr, 3 to 100
μmol/L for C2, and 0.1 to 10 μmol/L for C6, C8, and C10.
Accuracy was assessed by recovery tests and found to range between 93 and 105%,
whereas intra- and inter-day imprecision was less than 10% and 15%,
respectively, for all analytes. The method was highly selective since no
interferences from isobaric compounds or other matrix effects were observed.
Finally, the method was evaluated by analyzing 450 newborn blood spot samples
and by comparing the results with those determined with a commercially
available semi-quantitative MS kit that includes deuterated compounds as
internal standards. The results obtained by the two methods were consistent
concerning the samples with values lying within the physiological range as well
as the few outliers.
Taking into account the excellent analytical performance of the method and the
short assay time (5 min per sample) that permits analysis of more than 250
samples per 24 h, the method developed should find wide application for PKU and
MCADD newborn screening.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
