Η σκλήρυνση κατά πλάκας (πολλαπλή σκλήρυνση ή Σ.Κ.Π. εν συντομία) είναι μια χρόνια, προοδευτική, ανοσο-επαγούμενη διαταραχή του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) που χαρακτηρίζεται από φλεγμονή, απομυελίνωση και βλάβη των νευραξόνων καταλήγοντας σε νευροεκφυλισμό. Η ΣΚΠ είναι μια αυτοάνοση ασθένεια που επηρεάζει κυρίως τα άτομα στην πρώιμη ενήλικη ζωή τους και αποτελεί την πλέον διαδεδομένη χρόνια φλεγμονώδη νόσο του ΚΝΣ, η οποία πλήττει περισσότερα από 2 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως. Η ασθένεια παρουσιάζει σύνθετη παθογένεση και γενικά πιστεύεται ότι σχετίζεται με φλεγμονώδη και επαγωγικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που συσσωρεύονται στη λευκή ουσία και εμπλέκονται στην εμφάνιση, επιτόπου, εστιακών βλαβών μεταβαλλόμενης έντασης και ανοσολογικής δραστηριότητας. Τα φλεγμονώδη διηθήματα περιλαμβάνουν CD4 και CD8 Τ λεμφοκύτταρα, ενεργοποιημένα μονοκύτταρα και Β λεμφοκύτταρα και εντοπίζονται εντός βλαβών του ΚΝΣ, προκαλώντας την καταστροφή του ελύτρου μυελίνης του περιβάλλει τα νεύρα. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο αν η ΣΚΠ έχει μία ή περισσότερες αιτίες και επιπλέον οι μηχανισμοί ενεργοποίησης της είναι ασαφείς. Τα κλινικά συμπτώματα ποικίλλουν ανάλογα με την έκταση και τον εντοπισμό της βλάβης, ενώ ο κλινικός φαινότυπος της ΣΚΠ είναι πολύ ετερογενής και η πορεία της νόσου απρόβλεπτη. Οι παθολογικές εκδηλώσεις περιλαμβάνουν μείωση της αισθητήριας λειτουργίας, της κινητικότητας, της ισορροπίας, της λειτουργίας του σφιγκτήρα, της όρασης και της γνωστικής λειτουργίας. Μεταξύ των κυρίαρχων νευροπαθολογικών χαρακτηριστικών της νόσου, εκείνη της απώλειας νευραξόνων είναι ιδιαίτερα σημαντική διότι αποτελεί τον βασικό μηχανισμό μόνιμης κλινικής αναπηρίας. Η έναρξη της ΣΚΠ, στις περισσότερες των περιπτώσεων, χαρακτηρίζεται από οξεία συμπτώματα, ακολουθούμενα από πολλαπλούς κύκλους υποτροπής και ύφεσης, καθένας από τους οποίους συμβάλλει στη συσσώρευση της αναπηρίας. Με την πάροδο του χρόνου, η υποτροπιάζουσα ΣΚΠ (RRMS) μετατρέπεται σε προοδευτική σε φύση μορφή της νόσου και περίπου το 50% των ασθενών με RRMS μεταπίπτουν στη δευτεροπαθή προϊούσα ΣΚΠ (SPMS) μορφή, που χαρακτηρίζεται από λειτουργική επιδείνωση του ασθενή, η οποία δεν μπορεί να αντιμετωπιστεί με τις διαθέσιμες θεραπείες. Σε μια μικρή μερίδα των ασθενών (10-15%), η πορεία της νόσου είναι προοδευτική εξαρχής χωρίς εμφανείς υφέσεις και αναφέρεται ως πρωτογενής προϊούσα ΣΚΠ (PPMS). Η διάγνωση της PPMS συνδέεται με δυσμενέστερη μακροπρόθεσμη έκβαση. Συνολικά, ούτε η συχνότητα των υποτροπών (δραστηριότητα της νόσου) ούτε η συσσώρευση αναπηρίας αντιπροσωπεύει ακριβή μέθοδο πρόβλεψης της πορείας της ασθένειας.
Στη διάρκεια των τελευταίων δυο δεκαετιών υπήρξε αξιοσημείωτο ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση εύρεσης βιοδεικτών έναντι της ΣΚΠ που θα μπορούσαν να διευκολύνουν και να εξωραΐσουν την κλινική διαχείρισή της, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής των ασθενών και τα μακροπρόθεσμα κλινικά αποτελέσματα. Η προσπάθεια καθιέρωσης κατάλληλων βιοδεικτών για την ΣΚΠ έχει αποδειχθεί πολύ δύσκολη, και σήμερα, δεν υφίστανται επιβεβαιωμένοι βιοδείκτες ορού που επιδεικνύουν την επιθυμητή ευαισθησία και ειδικότητα, ώστε να είναι εκλέξιμοι για αξιόπιστη διαφορική διάγνωση της νόσου. Επίσης, λόγω της έντονης ετερογένειας στη παθοφυσιολογίας της ΣΚΠ, απουσιάζουν και οι προγνωστικοί δείκτες. Οι διαφορετικές μορφές της ΣΚΠ δημιουργούν μείζονες προκλήσεις για την ανακάλυψη βιοδεικτών. Με άλλα λόγια, ποικίλοι μηχανισμοί φλεγμονής-απομυελίνωσης, επαναμυελίνωσης, νευραξονικής βλάβης και νευροεκφυλισμού συνδυάζονται με διαφορετικούς τρόπους για να δημιουργήσουν ένα μοναδικό κλινικό αποτέλεσμα σε κάθε ασθενή. Συνεπώς, η χρήση ενός βιοδείκτη για μια μορφή της νόσου πιθανότατα να μην παρουσιάζει την ίδια αξία για άλλες μορφές, και επομένως, ο εντοπισμός προβλεπτικών βιοδεικτών στην ΣΚΠ παραμένει ένας κρίσιμος και ανοιχτός τομέας στην έρευνα.
Ευτυχώς, με την τεχνολογική πρόοδο στα «omics» πεδία, έχουμε σήμερον τα εργαλεία εκείνα για την συστηματική εξέταση βιολογικών υγρών σε αναζήτηση βιοδεικτών που ιδανικά θα κάλυπταν ποικιλία αναγκών στην κλινική πρακτική. Η πρωτεομική αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι στην έρευνα της βιολογίας συστημάτων, καθότι οι πρωτεΐνες όντας πλούσιες σε πληροφορίες για την λειτουργία του κυττάρου και κατ’ επέκταση του ίδιου του οργανισμού, έχουν αποδειχθεί εξαιρετικά πολύτιμες για την περιγραφή πληθώρας βιολογικών διεργασιών, πολλών εκ των οποίων, σε άμεση συσχέτιση με μηχανισμούς παθογένεσης. Η ανακάλυψη και επικύρωση βιοδεικτών, μέσω πρωτεομικής, είναι μια εφαπτόμενη διαδικασία στο πεδίο της κλινικής πρωτεομικής, όπου οι αναλυτικές προσεγγίσεις με βάση τη φασματομετρία μάζας αποσκοπούν στον εντοπισμό και την επαλήθευση βιοδεικτών πρωτεϊνικής φύσεως που μπορούν να διαφοροποιήσουν ομάδα ασθενών από εκείνη υγιών ατόμων. Τα εγγενή αναλυτικά πλεονεκτήματα της φασματομετρίας μάζας, συμπεριλαμβανομένων της αναλυτικής ευαισθησίας, ταχύτητας και απόδοσης, σε συνδυασμό με την προηγμένη βιοπληροφορική επεξεργασία αποτελεσμάτων για την ερμηνεία των δεδομένων, επιτρέπουν την ταχεία και συστηματική μελέτη χιλιάδων πρωτεϊνών. Ιδιαιτέρως, πέρα από την ταυτοποίηση, η φασματομετρία μάζας, μέσω χρήσης ισοτοπικά επισημασμένων προτύπων, προσφέρει τη δυνατότητα της απόλυτης ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών.
Η πρωτεομική που βασίζεται στη φασματομετρία μάζας αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο, μη επεμβατική και υψηλής απόδοσης, για τη μέτρηση αξιόπιστων βιοδεικτών με ακρίβεια και υψηλή ειδικότητα. Κατά αυτόν τον τρόπο, τέτοιοι δείκτες διαλευκάνουν τις παθογόνες βιολογικές διεργασίες ή φαρμακολογικές αποκρίσεις προς έγκυρη και έγκαιρη διάγνωση αφενός, και αφετέρου, για αξιόπιστη πρόγνωση ασθενειών. Έχοντας αυτά κατά νου, ο στόχος της παρούσας έρευνας επικεντρώνεται στην ανάπτυξη στοχευμένης πρωτεομικής ανάλυσης βασισμένης στην τεχνική υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) – συγκεκριμένα μεθοδολογιών που βασίζονται στη μέθοδο SRM (selected reaction monitoring) και αποτελούν εξέλιξη αυτής, όπως οι μέθοδοι MRM (multiple reaction monitoring) και PRM (parallel reaction monitoring) που είναι κατάλληλες για την ανάδειξη βιοδεικτών. Αυτές οι τεχνικές εφαρμόστηκαν σε δείγματα ορού για τη διερεύνηση επιλεγμένων πρωτεϊνών ως πιθανών βιοδεικτών της ΣΚΠ. Οι συγκεκριμένες στοχευμένες μέθοδοι ανιχνεύουν και ποσοτικοποιούν, ταυτοχρόνως, αντιπροσωπευτικά πεπτίδια παραγόμενα εκ των πρωτεϊνών (θρυψινοποίηση) που ενυπάρχουν στα δείγματα ορού των ασθενών. Επικεντρωθήκαμε σε ένα ειδικό υποσύνολο πεπτιδίων, μοναδικά σχετιζόμενων, με τις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος (πρωτεοτυπικά πεπτίδια). Για κάθε πεπτίδιο, μια σειρά από transitions (ζεύγη πρόδρομων ιόντων και θραυσμάτων τους, γνωστών m/z) καταγράφονται κατά τη διάρκεια ολόκληρου του χρωματογραφικού διαχωρισμού. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιείται μέσω των σημάτων που εξάγονται από τα παραγόμενα ιοντικά θραύσματα, υπολογίζοντας τις περιοχές κάτω από την καμπύλη (AUC areas) των χρωματογραφικών κορυφών κάθε ιοντικού θραύσματος σε συνάρτηση με το χρόνο έκλουσης. Σε όλα τα στάδια, ο σχεδιασμός της ανάλυσης, η βελτιστοποίηση της μεθόδου και η επεξεργασία των δεδομένων διευκολύνεται και επιταχύνεται με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής, και συγκεκριμένα του λογισμικού Skyline, το οποίο είναι ένα ελεύθερο λογισμικό για τη δημιουργία πρωτεομικών μεθόδων και την ποσοτική ανάλυση αποτελεσμάτων. Χρησιμοποιούμε συγκεκριμένα κριτήρια κατά την αξιολόγηση των δεδομένων προκειμένου να επιλέξουμε εκείνα τα πεπτίδια με τις βέλτιστες χρωματογραφικές και φασματομετρικές ιδιότητες. Επιπροσθέτως, μόνο τα πιο ειδικά και αποδοτικά transitions χρησιμοποιούνται για να ληφθούν οι μετρήσεις, καθώς αυτό καθορίζει την ευαισθησία της αναλυτικής μεθόδου.
Τέτοιου είδους πρωτεομική στρατηγική υποστηρίζει την έρευνα που παράγει συγκεκριμένες υποθέσεις από προϋπάρχουσα διαθέσιμη γνώση. Η υπόθεση σχεδόν πάντοτε προϋποθέτει ότι υφίσταται μοναδική και στενή ρύθμιση ομάδας πρωτεϊνών, η οποία υποδηλώνει τη λειτουργία ή τη διαδικασία που μας ενδιαφέρει. Στη μελέτη μας, η βάση της βιολογικής υπόθεσης ήταν το αποτέλεσμα εξονυχιστικής βιβλιογραφικής αναζήτησης πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην παθολογία και εξέλιξη της ΣΚΠ, κυρίως μέσω μηχανισμών ανοσοκαταστολής, οξειδωτικού στρες, διαταραχές του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB) και λοιπών νευροεκφυλιστικών διαταραχών. Εν τέλει, καταλήξαμε σε μια λίστα πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν κυτταροκίνες (IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-23), ιντερφερόνες (IFN-β, IFN-γ), άλλες κυτταροκίνες (TNF-α, OPN, CXCL13), και ένα ένζυμο αποικοδόμησης κολλαγόνου (MMP-9). Αυτοί είναι οι πρωτεΐνες-στόχοι πάνω στους οποίους αναπτύξαμε την αναλυτική τεχνική με LC-MS/MS.
Από όλες τις απόψεις, η μελέτη μας επιχειρεί να αποδείξει τη σημασία των ορολογικών αναλύσεων που διεξάγονται με επαναστατικές προσεγγίσεις πρωτεομικής, οι οποίες μπορούν να διευκολύνουν τις σημερινές διαγνωστικές διαδικασίες και να προωθήσουν την χρήση ομάδων βιοδεικτών για την καλύτερη αντιμετώπιση ασθενειών. Επιπροσθέτως, όσον αφορά την σκλήρυνση κατά πλάκας, η κλινική αναγκαιότητα της εξεύρεσης αξιόπιστων βιοδεικτών έγκειται στο γεγονός ότι απαιτείται η έγκαιρη και ακριβής διάγνωση, καθότι σήμερα υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπευτικές προσεγγίσεις για την υποτροπιάζουσα μορφή της νόσου.
Καταρχάς, ο στόχος προσδιορισμού και λήψης αξιόπιστων ποσοτικών μετρήσεων για αυτές τις πρωτεΐνες χαμηλής συγκέντρωσης στον ορό, που αποτελεί βιολογικό υγρό εξαιρετικά πολύπλοκης σύστασης, παρουσιάζει αυξημένη δυσκολία. Αρχικά, αναπτύξαμε μια μέθοδο MRM που εκτελείται σε ένα τριπλό τετράπολο φασματογράφο μάζας προς εντοπισμό και μέτρηση των πρωτεϊνών-στόχων (από τα προκύπτοντα ενδογενή πεπτίδια που τους αντιστοιχούν) τόσο σε ασθενείς όσο και σε ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα ήσαν ελπιδοφόρα για πέντε εκ των πρωτεϊνών στις οποίες παρατηρήσαμε ικανοποιητικές χρωματογραφικές ιδιότητες, που υποδείκνυαν τη δυνατότητα επαρκούς διαχωρισμού και ποσοτικοποίησης σε δείγματα ορών . Συνεπώς επιβεβαιώσαμε, εν γένει, τη δυνατότητα εκπλήρωσης του στόχου της μελέτης μας. Συνεχίζοντας παραπέρα, λόγω του ότι είχαμε στη διάθεσή μας ένα τελευταίας γενιάς φασματογράφο μάζας, το υβριδικό όργανο τετράπολο-τροχιακή παγίδα (quadrupole-orbitrap, Q Exactive), είχαμε την ευκαιρία να εφαρμόσουμε την επαναστατική μέθοδο PRM για να μετρήσουμε με αυξημένη ακρίβεια και αναλυτική ισχύ τις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος. Η αξιοσημείωτη διαχωριστική ικανότητα και ευαισθησία αυτού του οργάνου επιτρέπει τη μετατόπιση από έναν περιορισμένο αριθμό transitions που καθορίζονται για τον προσδιορισμό των εκάστοτε πεπτιδίων-στόχων (MRM) στον εντοπισμό όλων των προϊόντων θραυσματοποίησης (PRM). Τελικά με τη μέθοδο PRM, κατορθώσαμε να δημιουργήσουμε μια διαδικασία για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση κάθε πρωτεΐνης-στόχου της μελέτης, με υψηλής ποιότητας αναλυτικά χαρακτηριστικά. Ως εκ τούτου είχαμε την δυνατότητα να παραγγείλουμε ισοτοπικά επισημασμένα πεπτίδια αναφοράς για την εκτέλεση πειραμάτων επικύρωσης της μεθόδου και απόλυτης ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών. Εν τω μεταξύ, διεξαγάγαμε δοκιμές σύγκρισης της μεθόδου μας με άλλες καθιερωμένες αναλυτικές τεχνικές προσδιορισμού πρωτεϊνών (π.χ. ELISA για IL-6, IL-12/23, IL-10, TNF-α, IFN-γ, και δύο τεχνικές για την ΜΜΡ-9, Western Blot και Zymography). Εκ του αποτελέσματος, οι άλλες τεχνικές στερούνται αναλυτικής ευαισθησίας και αναπαραγωγιμότητας και ως εκ τούτου αδυνατούν να προσδιορίσουν με την ίδια αποτελεσματικότητα, όπως η μέθοδος LC-MS/MS που αναπτύξαμε, αυτές τις σπάνιες πρωτεΐνες στον όρο του αίματος.
(EL)
Multiple sclerosis (MS) is a chronic, progressive, immune-mediated central nervous system (CNS) disorder characterized by inflammation, demyelination and axonal damage leading to neurodegeneration. MS is an autoimmune disease which predominantly affects individuals in their early adult life and consists the most prevalent chronic inflammatory disease of the CNS, affecting more than 2 million people worldwide. The disease exhibits complex pathogenesis that is generally assumed to be related to inflammatory cells and mediators of immune system accumulating in white matter and forming focal lesions of altering intensity and immunologic activity. Inflammatory infiltrates including CD4 and CD8 T cells, activated monocytes, and B cells are present within lesions in the CNS resulting in degradation of the myelin sheath surrounding nerves. However, it is not known whether MS has a single or multiple causes and still the trigger mechanisms are ambiguous. Clinical symptoms vary depending on the lesion burden and location, whereas the clinical phenotype of MS is very heterogeneous and the course of the disease is difficult to predict. Pathological presentations include decline in sensation, mobility, balance, sphincter function, vision, and cognition. Among neuropathological hallmarks, axonal loss is particularly relevant because it is the main underlying mechanism of permanent clinical disability. The onset of MS in most cases is characterized by acute symptoms, followed by multiple cycles of relapse and remission, each of which contributes to accumulating disability. Over time, relapsing remitting MS (RRMS) becomes progressive in nature and approximately 50% of RRMS patients develop secondary progressive MS (SPMS), characterized by treatment-resistance functional deterioration. In a minority of patients (10-15%), the disease course is progressive from onset without discernible remissions, and is referred to as primary progressive MS (PPMS). Diagnosis of PPMS is associated with poorer long-term outcome. Altogether, neither the frequency of relapses (disease activity) nor the accumulated disability represents an accurate predictor of disease outcome.
Over the last two decades there has been considerable interest in finding biomarkers for MS that could facilitate and ameliorate clinical management improving patients’ quality of life and long-term outcome. The effort of establishing satisfactory biomarkers for MS has proven to be very difficult, and currently, no validated serum biomarkers have adequate sensitivity and specificity to be eligible for the differential diagnosis of MS and because of disease’s pathophysiological heterogeneity, also prognostic markers are absent. The different types of MS create major challenges for biomarker discovery. In other words, different mechanisms of inflammation-demyelination, remyelination, axonal damage and neurodegeneration combine together in various degrees to create a unique clinical result for each patient. Consequently, using a biomarker for one disease type may not be useful for other types, and so the identification of predictive biomarkers in MS remains a critical and open question in the field.
Fortunately, with the advances in ‘omics’ technologies, we now have the tools to systematically screen body fluids for novel biomarkers yielding a variety of clinical applications. Proteomics is an essential component of systems biology research because proteins are rich in information that has turned out to be extremely valuable for the description of biological processes. Proteomic biomarker discovery and validation is a major application of clinical proteomics research in which mass spectrometry-based approaches aim to identify and verify protein biomarkers that can differentiate a cohort of disease patients from a group of control individuals. The inherent analytical advantages of mass spectrometry including sensitivity, resolution, speed and throughput, combined with advanced bioinformatics for data interpretation, allow for the rapid and systematic analysis of thousands of proteins. Significantly, beyond identification, mass spectrometry also facilitates quantification – an imperative requirement in clinical proteomics in order to provide unique information about disease-associated alterations at the protein level.
Mass spectrometry-based proteomics hold promise as a noninvasive and high-throughput means of distinguishing reliable biomarkers – accurately measured and evaluated as indicators of highly specific disease/pathology-related signatures – elucidating pathological processes or pharmacological responses to treatment strategies for confident early diagnosis and disease prognosis. In that respect, our research objective focuses on the development of quantitative targeted proteomics assays based on liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) analytical techniques – namely selected reaction monitoring (SRM) derived methods e.g. MRM (multiple reaction monitoring) and PRM (parallel reaction monitoring). These approaches allow the measurement of predefined proteins across multiple samples in a consistent, reproducible and quantitatively precise manner elucidating their clinical potential as disease biomarkers in serum samples of patients with multiple sclerosis. Such targeted methods simultaneously detect and quantify surrogate peptides originating from proteins present in patients’ sera and as the approach is hypothesis-driven, it targets a very specific subset of peptides uniquely associated with the proteins of interest (proteotypic peptides). For each peptide, a series of transitions (pairs of precursor and fragment ion m/z values) are monitored either during a time that specifically corresponds with its predicted elution time (scheduled MRM/PRM) or over the full chromatographic separation (the case in our study). The actual quantification is performed by calculating the area under the curve of the signals (fragment ions reaching the detector) created by integration of the chromatographic peaks of each fragment ion (retrieved from the extracted ion chromatogram, XIC) in relation to retention time. In all stages, assay design, method optimization and data processing are facilitated and accelerated by employing bioinformatics tools, namely Skyline software, which is an open source software for targeted proteomics method creation and quantitative data analysis. Effectively, we applied several constraints during data evaluation in order to select the peptides with the most preferable chromatographic and mass spectrometric properties, and additionally, only the top-performing transitions (most intense and specific signal) were utilized to obtain the measurements, as these determine the sensitivity of the assays.
Such a proteomic strategy supports the standard way of biological inquiry, where specific hypotheses are generated from the available knowledge and then tested. The hypothesis is almost invariably that unique and tight regulation of a group of proteins underlies the function or process of interest. On this project, the biologically informative hypothesis was the result of thorough literature mining of proteins engaging to multiple sclerosis causation and progression, mainly, in immune regulation mechanisms, oxidative stress, blood brain barrier (BBB) disruption, and neurodegenerative procedures. Ultimately, we decided to focus our study on a list of proteins including cytokines (IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-23), interferons (IFN-β, IFN-γ), other cytokines (TNF-α, OPN, CXCL13), and a collagen degrading enzyme (MMP-9). These would be the targets upon which we developed the LC-MS/MS quantitative assays.
In all respects, our study attempts to establish the importance of serological testing, performed by revolutionary proteomics approaches that can facilitate today’s diagnostic procedures by measuring biomarker panels. Moreover, regarding multiple sclerosis, a clinical necessity lies on the fact that an early and accurate diagnosis is essential because effective treatment for RRMS is available. Certainly, the absence of either diagnostic or prognostic biomarkers is currently limiting the options for clinical management of multiple sclerosis.
Primarily, the goal of measuring and obtaining valid quantitative values for these low-abundance proteins, in such a complex matrix as serum, is of increased difficulty. Initially, we developed an MRM method in a triple-quadrupole mass spectrometer to identify and measure the targeted proteins (inferred by their endogenous detected corresponding peptides) on both cases and controls. The results were promising for five proteins which yielded satisfactory chromatographic properties for confident separation and quantification in sera samples, and in consequence ascertained the feasibility of our objective. Thereon, owing to the fact that we had at our disposal a more technologically advanced mass spectrometer, a hybrid quadrupole-orbitrap instrument (Q Exactive), we had the opportunity to employ the revolutionary and powerful PRM method to accurately measure our proteins of interest. The high resolution and sensitivity of this state-of-the-art instrument enables the shift from monitoring a limited number of transitions defined for each peptide (MRM) to monitoring all generated transitions after the fragmentation of selected precursor ions (PRM) with greater precision and at lower detection limits. Eventually with PRM, we managed to build a method for identification and quantification of every target protein with high-quality analytical characteristics, which enabled us to order isotopic-labeled reference peptides for assay validation and absolute quantification experiments. In the meantime, we conducted comparison tests between other well-established analytical techniques (i.e., ELISA for IL-6, IL-12/23, IL-10, TNF-α, IFN-γ, and two techniques for MMP-9, Western Blot and Zymography) and our mass spectrometry-based assay to figure out which approach performs better with increased analytical sensitivity and reproducibility. In few words, the other techniques could not achieve the required sensitivity for determining the concentration of these low-abundance proteins in serum, and pointed out that our LC-MS/MS method is far more adequate for this task.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
