Τις τελευταίες δεκαετίες, η παρουσία των αναδυόμενων ρύπων στο υδάτινο περιβάλλον αποτελεί θέμα ανησυχίας μεταξύ των επιστημόνων. Οι φαρμακευτικές ενώσεις είναι μία από τις κύριες κατηγορίες αναδυόμενων ρύπων και η κατανάλωση τους έχει αυξηθεί ραγδαία τις τελευταίες δεκαετίες. Οι φαρμακευτικές ενώσεις συχνά καταλήγουν στα υδάτινα οικοσυστήματα εξαιτίας της αναποτελεσματικής απομάκρυνσής τους από τα κέντρα επεξεργασίας λυμάτων. Η απελευθέρωση των φαρμακευτικών ενώσεων στο υδάτινο περιβάλλον μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα τη βιοσυσσώρευση και την πρόκληση αρνητικών επιπτώσεων στους υδρόβιους οργανισμούς και ίσως τελικά στην υγεία των ανθρώπων. Η πλειοψηφία των φαρμακευτικών ενώσεων είναι ιονίζουσες οργανικές ενώσεις, και συνεπώς, η χημική τους μορφή (ουδέτερη ή ιονισμένη) καθορίζεται από την τιμή pH του περιβάλλοντος. Η πρόσληψη των ιονίζουσων οργανικών ενώσεων, και άρα και η τοξικότητά τους, επηρεάζεται σημαντικά από τη μορφή με την οποία βρίσκονται και συνεπώς από τις διαφορετικές τιμές pH. Η ουδέτερη μορφή μιας ιονίζουσας ένωσης λόγω της χαμηλής της πολικότητας μπορεί να διαπεράσει ευκολότερα μέσω των μεμβρανών και άρα η τοξικότητα της ενδέχεται να είναι μεγαλύτερη. Μεταξύ των ιονίζουσων ενώσεων είναι και η Μετοπρολόλη, ένας εκλεκτικός β-αναστολέας που χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία καρδιοαγγειακών παθήσεων. Πιο συγκεκριμένα, πρόκειται για μια δευτεροταγής αμίνη με pKa= 9.68. Αυτό σημαίνει ότι το ποσοστό της ουδέτερης μορφή της αυξάνεται με την αύξηση του pH, και συνεπώς αναμένεται η πρόσληψη και η τοξικότητα της μετοπρολόλης να είναι αυξημένες σε αλκαλικές τιμές pH. Παρόλα αυτά, μέχρι στιγμής, δεν έχει μελετηθεί εκτενώς η επίδραση του pH στην τοξικότητα της μετοπρολόλης. Το zebrafish αποτελεί ένα ισχυρό εναλλακτικό μοντέλο-οργανισμός με ευρεία χρήση της οικοτοξικολογικές μελέτες για την αξιολόγηση των πιθανών επιπτώσεων των ξενοβιοτικών της υδρόβιους οργανισμούς. Το zebrafish εμφανίζει πολλά πλεονεκτήματα, μεταξύ των οποίων είναι η ικανότητα βιομετατροπής των ξενοβιοτικών μέσω αντιδράσεων της φάσης Ι και φάσης ΙΙ.
Λαμβάνοντας υπόψιν όλα τα παραπάνω, της από της κυριότερους στόχους της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της της επίδρασης του pH στην πρόσληψη, στην τοξικότητα και τη βιοσυσσώρευση της μετοπρολόλης σε έμβρυα zebrafish. Της ακόμα σημαντικός στόχος ήταν η μελέτη της ικανότητας βιομετατροπής της μετοπρολόλης των εμβρύων zebrafish και η ανίχνευση των πιθανών προϊόντων βιομετατροπής. Ο τελικός στόχος ήταν η πρόταση της πιθανού μεταβολικού μονοπατιού της μετοπρολόλης.
Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε τεστ τοξικότητας με έμβρυα zebrafish σε τρεις τιμές pH 6, 8 και 9. Τα έμβρυα zebrafish εκτέθηκαν στη μετοπρολόλη σε ένα εύρος συγκεντρώσεων, με σκοπό να προσδιοριστούν οι τιμές LC50 της μετοπρολόλης σε κάθε τιμή pH. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε τοξικοκινητικό πείραμα όπου τα έμβρυα zebrafish εκτέθηκαν στη μετοπρολόλη σε συγκέντρωση που αντιστοιχούσε στην τιμή LC50 για κάθε τιμή pH. Τα δείγματα νερού από την αρχή (0 h) και από το τέλος (96h) του τοξικοκινητικού πειράματος, καθώς και τα δείγματα zebrafish αναλύθηκαν με LC-Q-TOF-MS κάνοντας χρήση δύο χρωματογραφικών τεχνικών (RPLC και HILIC) και δύο πολικοτήτων (θετική και αρνητική). Για την ταυτοποίηση της μετοπρολόλης, εφαρμόστηκε στοχευμένη σάρωση, ενώ για την ταυτοποίηση των προϊόντων βιομετατροπής, εφαρμόστηκε σάρωση ύποπτων ενώσεων.
Προσδιορίζοντας τις τιμές LC50 της μετοπρολόλης στις τρεις τιμές pH, βρέθηκε ότι η μετοπρολόλη είναι πιο τοξική στο pH 9, καθώς η τιμή LC50 στο pH 9 ήταν περίπου 300 φορές χαμηλότερη από το στο pH 6. Τα αποτελέσματα αυτά συσχετίστηκαν με το αυξημένο ποσοστό ουδέτερης μορφής της μετοπρολόλης σε υψηλότερες τιμές pH. Αντίστοιχα, ο παράγοντας βιομετατροπής της μετοπρολόλης στο pH 9 ήταν 155 φορές μεγαλύτερος από τον παράγοντα βιομετατροπής στο pH 6. Από την άλλη πλευρά, οι εσωτερικές συγκεντρώσεις ήταν στο ίδιο εύρος τιμών σε όλες τις τιμές pH. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας επιβεβαιώνουν την εξάρτηση της τοξικότητας και της βιοσυσσώρευσης της μετοπρολόλης από το pH, και της μη εξάρτησης της εσωτερικής συγκέντρωσης από το pH. Για το λόγο αυτό, οι εσωτερικές συγκεντρώσεις ακριβέστερο μέτρο της τοξικότητας μιας ένωσης. Επιπλέον, τονίζεται η σημασία της μελέτης του pH στις δοκιμές τοξικότητας των ιονίζουσων οργανικών ενώσεων καθώς σε αντίθετη περίπτωση, η τοξικότητά τους μπορεί να υπό/υπέρ-εκτιμηθεί.
Όσων αφορά τη βιομετατροπή στα έμβρυα zebrafish, ανιχνεύθηκαν συνολικά δέκα (10) προϊόντα βιομετατροπής. Το κύριο μονοπάτι βιομετατροπής της μετοπρολόλης ήταν η υδροξυλίωση. Η συνδυαστική χρήση δύο χρωματογραφικών τεχνικών (RPLC και HILIC) συνέβαλε στην ορθογώνια ταυτοποίηση των περισσότερων προϊόντων βιομετατροπής. Βασιζόμενοι στα υπάρχοντα δεδομένα, αυτή είναι η πρώτη φορά που μελετάται η βιομετατροπή της μετοπρολόλης στα έμβρυα zebrafish. Το γεγονός ότι η μετοπρολόλη βιομετατρέπεται σε μεγάλο βαθμό στα έμβρυα zebrafish υπογραμμίζει την ανάγκη να συμπεριλαμβάνεται η μελέτη της βιομετατροπής στις μελέτες τοξικότητας.
(EL)
Over the last decades, the presence of emerging contaminants in the aquatic environment has become an issue of concern among scientists. Pharmaceutical compounds are one of the main categories of emerging contaminants and their consumption has significantly increased in the last decades. Pharmaceutical compounds end up in the aquatic environment, due to their inefficient removal from the conventional WWTPs. Once they release into the aquatic ecosystem, pharmaceuticals may bioaccumulate in aquatic organisms causing negative effects. Additionally, the majority of the pharmaceuticals are ionizable organic compounds (IOCs); therefore, their chemical speciation (ionic or neutral form) is defined by the surrounding pH value. The uptake of the IOCs, and as a result their toxicity, is strongly affected by their speciation, and hence by the different pH values. The non-ionized form of an IOC, which is less polar, can transport faster across membranes than the corresponding ionized one, and thus it may be more toxic for the organisms. Among IOCs is the Metoprolol (MET), a cardioselective b-blocker which widely used for the treatment of cardiovascular diseases. More specifically, MET is a secondary amine with pKa= 9.68. Therefore, the percentage of the neutral form is increased with pH increasing, and as a result, the uptake and the toxicity of MET are expected to be higher at alkaline pH values. However, so far, the pH-dependent toxicity of Metoprolol has not been extensively investigated. Zebrafish (Danio rerio) has emerged as a powerful alternative model organism, which is widely used in ecotoxicological research studies for evaluating the potential effects of xenobiotics on aquatic organisms. Zebrafish embryos (ZFE) exhibit numerous beneficial traits, such as their capacity to biotransform xenobiotics via Phase I and Phase II reactions.
Considering all the above, one of the main objectives of the current master thesis was the study of the influence of environmentally relevant pH values on the uptake, potential toxicity, and bioaccumulation of Metoprolol in ZFE. Another important purpose was the investigation of the biotransformation capacity of ZFE exposed to MET and the identification of the tentative biotransformation products (bio-TPs). The final goal was to elucidate the main metabolic pathways of MET in ZFE.
For this purpose, the fish embryo test (FET) with ZFE was conducted at three pH values 6, 8, and 9. The ZFE were exposed to Metoprolol for 96 hours in a range of different concentrations for each pH value to determine the LC50 of MET at each pH value. Afterward, the ZFE (96 hpf) were exposed to MET at a concentration equivalent at their LC50 value per each pH value. The water samples from the start (0 h) and the end (96 h) of the toxicokinetic experiment, as well as the ZFE samples, were analyzed utilizing liquid chromatography coupled to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (LC-QTOF-MS) by combinatorial use of reversed-phase liquid chromatography (RPLC) and hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC), in positive and negative ionization mode. For the identification of the parent compound MET target screening approach was followed, while the identification of the (bio-TPs) was carried out with suspect screening.
Determining the LC50 values of MET at the three pH values, it was found that MET is more toxic at pH 9 since the LC50 value at pH 9 was 300 times lower than the LC50 at pH 6. These results were associated with a higher percentage of the neutral species of MET at higher pH values. Respectively, the bioconcentration factor (BCF) of MET at pH 9 was 155 times higher than the BCF at pH 6. On the other hand, the internal concentrations (Cint) of MET were at a similar range at all pH values. The results of our study confirm the pH-dependent toxicity and bioaccumulation of MET and the pH-independence of internal concentrations. For this reason, it was concluded that Cint is a more accurate measurement of the toxicity of a test compound. Moreover, the importance of investigating the pH factor in the environmental toxicity tests of the IOCs is pointed out. Otherwise, the toxicity of the IOCs may be under-or over-estimated.
Regarding the biotransformation of MET in ZFE, a total of ten (10) bio-TPs were detected and all of them were tentatively identified. The primary metabolic pathway of MET was the hydroxylation (phase I reaction). The complementary use of two different chromatographic techniques, RPLC and HILIC, achieved the orthogonal identification for the most bio-TPs. To the best of our knowledge, this is the first time that biotransformation of MET in ZFE is investigated. The fact that the compound Metoprolol is highly biotransformed in the ZFE highlights the importance to study thoroughly the biotransformation in toxicokinetic studies.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
