Το γάλα είναι το πρώτο σε κατανάλωση υγρό τρόφιμο σε παγκόσμια κλίμακα, λόγω της υψηλής διατροφικής του αξίας, των πλούσιων οργανοληπτικών χαρακτηριστικών και του σχετικά χαμηλού του κόστους. Τα τελευταία χρόνια έχει αποδειχθεί πως είναι το τέταρτο πιο ευάλωτο τρόφιμο σε πρακτικές νοθείας, και ειδικότερα στην προσθήκη αγελαδινού σε γάλατα άλλων ειδών, όπως το κατσικίσιο, το πρόβειο, το βουβαλίσιο ή το γαϊδουρινό, λόγω του χαμηλότερου κόστους και της μεγαλύτερης εποχικότητάς του. Το γεγονός αυτό δεν οδηγεί απλώς σε κρίση των εμπορικών σχέσεων και σε δυσπιστία των καταναλωτών προς τη διεθνή αγορά τροφίμων, ιδιαίτερα όσον αφορά τα προϊόντα Προστατευόμενης Ονομασίας Προέλευσης (Π.Ο.Π) και Προστατευόμενης Γεωγραφικής Ένδειξης (Π.Γ.Ε) αλλά αποτελεί και σοβαρή απειλή προς τη δημόσια υγεία, λόγω της πρόκλησης αλλεργικών αντιδράσεων από πρωτεΐνες του αγελαδινού, μη αναγραφόμενου στις ετικέτες, γάλατος. Οι μεθοδολογίες ανίχνευσης της εν λόγω νοθείας διακρίνονται σε αυτές που ανιχνεύουν ειδικές πρωτεΐνες του αγελαδινού γάλατος που χαρακτηρίζονται από μειωμένη ειδικότητα και ευαισθησία και σε αυτές που ανιχνεύουν το DNA του εκάστοτε ζώου που έχουν ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα ευαισθησίας και ειδικότητας. Στην παρούσα μελέτη, στόχος μας ήταν η ανίχνευση του αγελαδινού γάλατος με παράλληλη ταυτοποίηση του αναγραφόμενου ζωικού είδους, στη δική μας περίπτωση κατσικίσιου ή πρόβειου, στην ίδια ανάλυση με ανάπτυξη ειδικής PCR μεθοδολογίας. Αναπτύχθηκε μέθοδος διπλής touch-down (TD) PCR, μετά από ειδική τροποποίηση των ειδικών για το αγελαδινό DNA εκκινητών και ταυτοποίηση των προϊόντων με εμφανώς διακριτές καμπύλες τήξης (Τm). Η μέθοδός μας χαρακτηρίζεται από υψηλή ειδικότητα, μεταξύ αλληλουχιών άλλων ειδών, όπως το βουβαλίσιο ή το γαϊδουρινό, ενώ ανιχνεύτηκε η νοθεία σε αγελαδινό σε ποσοστό μέχρι 1%. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου αξιολογήθηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις αγελαδινού 5% και 1%, με την τιμή %RSD να διαμορφώνεται για το πρωτόκολλο του κατσικίσιου σε 1.53 και 2.04 αντίστοιχα, ενώ για του πρόβειου σε 2.49 και 7.16. Ακολούθησε εφαρμογή της μεθόδου σε εμπορικά διαθέσιμα κατσικίσια γάλατα με το 50% αυτών να χαρακτηρίζονται ως νοθευμένα από την αναπτυχθείσα μεθοδολογία. Τα ίδια γάλατα ελέγχθηκαν και με ένα εμπορικά διαθέσιμο ανοσοχρωματογραφικό κιτ, το οποίο επιβεβαίωσε τα 3 από τα 5 δείγματα ως νοθευμένα, καθώς και με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) που επιβεβαίωσε μόλις 2 νοθευμένα δείγματα. Η διαφορά των αποτελεσμάτων μπορεί να ερμηνευθεί από τα διαφορετικά μόρια-στόχους που αξιοποιεί η κάθε τεχνική (DNA και ανοσογλοβουλίνες αντίστοιχα), καθώς επίσης και από τις διαφορετικές αρχές μεθόδου και τα επίπεδα ευαισθησίας τους. Καταλήγοντας, η παρούσα μελέτη υπογραμμίζει τη σπουδαιότητα της ιχνηλασιμότητας των τροφίμων και του ελέγχου ποιότητας αξιοποιώντας ειδικές και ευαίσθητες μεθόδους, όπως η προτεινόμενη, και εντείνει την ανάγκη για επέκταση της εφαρμοσιμότητας των μοριακών αναλύσεων σε μια πιο ευρεία γκάμα προϊόντων διαφορετικών προελεύσεων.
(EL)
Milk is the most consumed liquid food in a global scale due to its high nutritional value, organoleptic characteristics, and relatively low cost. However, over the past decades, it has been found to be the fourth most vulnerable product to food adulteration malpractices, especially the addition of cow milk in other mammalian species’ milk, such as goat, sheep, buffalo or donkey, due to its lower price and high seasonal availability. This incident leads not only to crisis in the trade market and consumer insecurity, especially regarding the Protected Designation of Origin (PDO) or Protected Geographical Indication (PGI) products, but also consists a public health threat due to allergies caused by proteins found in the undeclared cow milk. This type of adulteration can be detected either via bovine-protein based methods, that show low sensitivity and specificity, or via molecular methods targeting each’ species DNA that show greater sensitivity and specificity. In the present study, aiming to simultaneously detect cow milk’s addition, while confirming the declared species’ milk in the same run, in our case goat or sheep milk, we developed a specific qualitative touch-down (TD) PCR method that relies on the discrimination of the melt curves’ peak areas after modifying the bovine-specific primers. Our method also presents high specificity among other species’ DNA templates, such as buffalo and donkey and is found capable of identifying the presence of bovine milk down to 1%. The repeatability was tested on the low bovine concentrations of 5% and 1% presenting an %RSD value of 1.53 and 2.04 respectively for the goat assay, in comparison with the values of 2.49 and 7.16 showed for the sheep assay. The application was performed on commercial goat milk samples resulting in 50% positive samples. The same samples were also tested both with a commercial rapid immunochromatographic kit which confirmed 3 out of the 5 positive samples, and with an ELISA kit which confirmed only 2 positive samples. This deviation can be justified by the different target molecules (DNA and immunoglobins respectively) and each method’s principles and sensitivity levels. This study underlines the importance of food traceability and quality control using specific and sensitive analytical methods as the one suggested here, and the expansion of their application in other food matrices or species.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
