Η αύξηση των πολυανθεκτικών παθογόνων (MDR) και οι περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές σε λοιμώξεις ανθεκτικές σε αντιβιοτικά, καθιστά κρίσιμη την έρευνα και ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών. Τα φυσικά προϊόντα και πιο συγκεκριμένα τα βακτήρια, αποτελούν βασική πηγή δραστικών μεταβολιτών με ποικίλες δράσεις. Το ποικιλόμορφο μικροβίωμα, το οποίο συναντάται στα διάφορα μέρη των φυτικών οργανισμών, και κυρίως αυτό της ριζόσφαιρας, διαδραματίζει καίριο ρόλο στην ανάπτυξη του φυτού και στην προστασία του από παθογόνους μικροοργανισμούς, μέσω ποικίλων μηχανισμών και ιδιαίτερα μέσω της παραγωγής αντιβιοτικών ουσιών για τη καταπολέμησή τους. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ακτινοβακτήρια του είδους Streptomyces, τα οποία χαρακτηρίζουν το μικροβίωμα της ριζόσφαιρας πολλών φυτικών οργανισμών, και διακρίνονται για τη παραγωγή αντιβιοτικών και αντιμυκητιασικών ουσιών.
Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα ερευνητική εργασία, είχε στόχο την απομόνωση και μελέτη στρεπτομύκητων από τη ριζόσφαιρα του φυτού Ebenus sibthorpii, με σκοπό την αξιολόγησή τους ως πηγή βιοδραστικών μεταβολίτων, με πιθανή αντιμικροβιακή δράση. Οι στρεπτομύκητες και η μελέτη τους για την απομόνωση νέων δραστικών ουσιών και κυρίως αντιβιοτικών, αποτελούν μία από τις τελευταίες τάσεις της σχετικής έρευνας.
Πραγματοποιήθηκε μία σειρά πειραμάτων, κατά την οποία απομονώθηκαν στρεπτομύκητες από τη ριζόσφαιρα του φυτού Ebenus sibthorpii, μελετήθηκε η δραστικότητά τους έναντι μικροοργανισμών δεικτών και επιλέχθηκε για περαιτέρω ανάλυση, στέλεχος στρεπτομύκητα με αντιβιοτική και αντιμυκητισιακή δράση. Το στέλεχος ταυτοποιήθηκε μέσω μοριακής ταυτοποίησης ως το είδος Streptomyces scopiformis, το οποίο καλλιεργήθηκε σε εργαστηριακή και πιλοτική κλίμακα και επεξεργάστηκε περαιτέρω με σκοπό την μελέτη του χημικού περιεχομένου τόσο των μικηλίων όσο και του θρεπτικού υλικού. Ταυτοποιήθηκαν, συνολικά εκατό (100) ουσίες από το θρεπτικό υλικό με τη χρήση αναλυτή LC/ESI/MS.
Σημαντικό κομμάτι της έρευνας, αποτέλεσε η εφαρμογή της τεχνικής της φυγόκεντρου εκχύλισης κατανομής (CPE). Μάλιστα, πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη μεθόδου για την επεξεργασίας μεγάλης ποσότητας θρεπτικού υλικού, με τη τεχνική της φυγόκεντρου εκχύλισης κατανομής. Με την εφαρμογή της μεθόδου αυτής επιτεύχθηκε ο καλός διαχωρισμός και η κλασμάτωση των ουσιών του θρεπτικού υλικού σε συνδυασμό με την εξοικονόμηση χρόνου πραγμάτωσης των πειραμάτων. Ακόμα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανάλυσης του χημικού περιεχομένου των μικηλίων της καλλιέργειας, αφού διαχωρίστηκαν από το θρεπτικό υλικό με τη τεχνική της φυγοκέντρισης. Το θρεπτικό υλικό επεξεργάστηκε περαιτέρω με το πείραμα της όξινης κατακρήμνισης των ουσιών του και σε ορισμένα από τα κλάσματα του, τα οποία ελήφθησαν από τη φυγόκεντρο εκχύλιση κατανομής, πραγματοποιήθηκε καθίζηση ιζήματος, με διαλύτες νερό (H2O) και ακετονιτρίλιο (ACN). Τα κλάσματα που προέκυψαν αναλύθηκαν με τη χρήση αναλυτή LC/ESI/MS.
Επίσης, τα κλάσματα, τα οποία προέκυψαν από τη φυγόκεντρο εκχύλιση κατανομής του θρεπτικού υλικού, επεξεργάστηκαν με εφαρμογή παρασκευαστικής χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (Preparative TLC), με αποτέλεσμα τον περαιτέρω διαχωρισμό των ουσιών και τη μελέτη τους με τη χρήση αναλυτή LC/ESI/MS. Η μελέτη της βιοδραστικότητας των παραγόμενων κλασμάτων, από την εργαστηριακή και την πιλοτική κλίμακα καλλιέργειας, έναντι των μικροοργανισμών δεικτών Candida albicans και Staphylococcus aureus, οδήγησαν στην εξαγωγή συμπερασμάτων για τη δράση των επιμέρους κλασμάτων του θρεπτικού υλικού.
Συμπερασματικά, η μελέτη ανέδειξε την αποτελεσματικότητα της πειραματικής πορείας που ακολουθήθηκε και της μεθόδου που αναπτύχθηκε, ως μία καλή προσέγγιση για την επεξεργασία και την έρευνα του χημικού περιεχομένου θρεπτικού υλικού καλλιέργειας στρεπτομυκήτων.
(EL)
The increase in multi-drug resistant pathogens (MDR) and limited treatment options for antibiotic resistant infections makes research and development of new antibiotics critical. Natural products, and more specifically bacteria, are a key source of active metabolites with diverse activities. The diverse microbiome, which is found in the different parts of plant organisms, especially in the rhizosphere, plays a key role in plant growth and protection against pathogens through a variety of mechanisms, in particular through the production of antibiotics to combat them. Of great interest are the radiobacteria of the species Streptomyces, which characterise the rhizosphere microbiome of many plant organisms, and are distinguished for their production of antibiotics and antifungal substances.
In this context, the present research work, aimed to isolate and study Streptomyces from the rhizosphere of Ebenus sibthorpii plant, in order to evaluate them as a source of bioactive metabolites with potential antimicrobial activity. Streptomyces and their study for the isolation of new active compounds, especially antibiotics, is one of the latest trends in related research.
A series of experiments were carried out in which streptomyces were isolated from the rhizosphere of Ebenus sibthorpii, their activity against indicator microorganisms was studied and a strain of streptomyces with antibiotic and antifungal activity was selected for further analysis. The strain was identified by molecular identification as Streptomyces scopiformis, which was cultured on laboratory and pilot scale and further processed to study the chemical content of both micelles and nutrient material. A total of one hundred (100) compounds were identified from the nutrient material using LC/ESI/MS analyzer.
An important part of the research was the application of the centrifugal distribution extraction (CPE) technique. In fact, the development of a method for the treatment of a large amount of nutrient material by the centrifugal distribution extraction technique was carried out. By applying this method, a good separation and fractionation of nutrient substances was achieved, together with saving time for the realization of experiments. Also, experiments were carried out to analyze the chemical content of the culture micelles after they were separated from the nutrient material by the centrifugation technique. The nutrient material was further processed by the acid precipitation experiment and some of the fractions obtained from the centrifugal extraction partitioning were subjected to sediment precipitation with water (H2O) and acetonitrile (ACN) as solvents. The resulting fractions were analyzed using LC/ESI/MS analyzer.
Furthermore, the fractions obtained from the centrifugal extraction of the nutrient partitioning were processed by preparative thin layer chromatography (Preparative TLC), resulting in further separation of the substances and their study using an LC/ESI/MS analyser. The study of the bioactivity of the produced fractions, from the laboratory and pilot scale culture, against the indicator microorganisms Candida albicans and Staphylococcus aureus, led to conclusions on the activity of the individual nutrient fractions.
In conclusion, the study demonstrated the effectiveness of the experimental course followed and the method developed as a good approach for the treatment and investigation of the chemical content of streptomyces culture nutrient material.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
