Εισαγωγή: Οι λοιμώξεις του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) προκαλούνται από βακτήρια, ιούς, μύκητες και παράσιτα και αποτελούν μια σοβαρή νόσο που μπορεί να προκαλέσει πολλαπλές και μακροχρόνιες συνέπειες στην υγεία του ασθενούς ακόμα και το θάνατο. Η έγκαιρη διάγνωση και αντιμετώπιση μπορούν να αποβούν κρίσιμες για τη μετέπειτα εξέλιξη της υγείας του ασθενούς. Τα δεδομένα μοριακής επιδημιολογίας λοιμώξεων του ΚΝΣ, ειδικότερα των ιογενών, που είναι διαθέσιμα για τον παιδιατρικό πληθυσμό είναι περιορισμένα.
Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν: 1) η διερεύνηση της σημασίας της συνδρομικής διάγνωσης για την ταχεία ανίχνευση λοιμώξεων του ΚΝΣ σε παιδιά με τη χρήση της πολυπλεκτικής (multiplex) αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ). Επιπλέον, κατά πόσο μπορεί η συνδρομική διάγνωση να συμβάλλει στη μείωση των ημερών χορήγησης αντιβιοτικών, νοσηλείας και τη μείωση του κόστους νοσηλείας.
2) η μοριακή ανίχνευση, γονοτύπηση και φυλογενετική ανάλυση των στελεχών εντεροϊών και parechovirus που θα απομονωθούν από λοιμώξεις ΚΝΣ ή σηπτικό σύνδρομο παιδιών και νεογνών. Επιπλέον η συσχέτιση του γονότυπου των ιών με τα κλινικά και επιδημιολογικά χαρακτηριστικά και τη βαρύτητα της νόσου παιδιών με λοίμωξη ΚΝΣ.
Ασθενείς και μέθοδος: Κατά την πρώτη περίοδο της διατριβής πραγματοποιήθηκε μία προοπτική μελέτη κοόρτης σε προηγουμένως υγιή παιδιά 0-16 ετών με κλινική υποψία μηνιγγίτιδας ή εγκεφαλίτιδας που νοσηλεύθηκαν στο Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία» κατά το χρονικό διάστημα 04/2018-04/2019. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν παιδιά στα οποία κατά τη κρίση του θεράποντα ιατρού έγινε λήψη ΕΝΥ και ευρέθησαν > 15 κύτταρα ανά mm3. Το ΕΝΥ ελέγθηκε με τη μέθοδο συνδρομικής διάγνωσης πολυπλεκτικής PCR για λοίμωξη ΚΝΣ FilmArray- ME που ελέγχει τους ακόλουθους μιρκοοργανισμούς: CMV, Enterovirus, HSV 1/2, HHV-6, Ηuman parechovirus (HpeV), VZV, Cryptococcus neoformans/gattii, Escherichia coli K1, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae (GBS), and Streptococcus pneumoniae. Για κάθε παιδί που ελέγχθηκε με συνδρομική διάγνωστική μέθοδο επιλέχθηκε ένα παιδί-μάρτυρας, εξομοιωμένης ηλικίας που το ΕΝΥ εξετάστηκε με μεμονωμένες PCR για συγκεκριμένους μικροοργανισμούς σύμφωνα με την κρίση του θεράποντα ιατρού. Το ΕΝΥ όλων των παιδιών εξετάστηκε με τις κλασσικές μικροβιολογικές μεθόδους
Τα τελικά αποτελέσματα που συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων παρέμβασης και μαρτύρων για την έκβαση, τη διάρκεια παραμονής στο νοσοκομείο, τη διάρκεια χορήγησης αντιμικροβιακών, και ακυκλοβίρης καθώς και το συνολικό κόστος νοσηλείας.
Κατά τη δεύτερη περίοδο 5/2019-12/2021 της διατριβής έγινε έλεγχος με συνδρομική διαγνωστική μέθοδο του ΕΝΥ σε όλα τα δείγματα ΕΝΥ παιδιών με υποψία λοίμωξης του ΚΝΣ χωρίς περιορισμό σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων στο ΕΝΥ.
Στα παιδιά που στα δείγματα ΕΝΥ ευρέθησαν εντεροϊοί (EV) ή HpeV συλλέχθηκαν δείγματα κοπράνων και φαρυγγικού και έγινε μοριακή ανάλυση με γονοτύπηση και φυλογενετική ανάλυση.
Αποτελέσματα: Τα παιδιά που πληρούσαν τα κριτήρια ένταξης στη μελέτη κοόρτης ήταν 142 (71 στην ομάδα συνδρομικής διάγνωσης). Παθογόνος μικροοργανισμός ανιχνεύθηκε σε 37/71 (52,1%) παιδιά με τη χρήση πολυπλεκτικής PCR και σε 16/71 (22,5%) στην ομάδα ελέγχου (τιμή P < 0,001). Σε περιπτώσεις άσηπτης μηνιγγίτιδας ανιχνεύθηκε ιός σε 27/61 (44,2%) και σε 11/66 (16,7%) στην ομάδα ελέγχου (τιμή P < 0,001). Διάμεση διάρκεια παραμονής σε ασθενείς και ομάδα ελέγχου με άσηπτη μηνιγγίτιδα ήταν 5 IQR(4-8) και 8 IQR(6-10) ημέρες, αντίστοιχα (τιμή P < 0, 001). Η διάμεση διάρκεια των αντιμικροβιακών σε ασθενείς και ομάδα ελέγχου ήταν 4 IQR(2-5,7) και 7 IQR(5-10) ημέρες αντίστοιχα (τιμή P < 0,001). Το κόστος νοσηλείας υπολογίστηκε σε ασθενείς και ομάδα ελέγχου στα 1042 € (932–1372) και 1522 € (1302–1742) αντίστοιχα (τιμή P < 0,001). Κατά τη δεύτερη περίοδο όταν γινόταν έλεγχος με πολυπλεκτική PCR σε όλα τα παιδιά ανεξάρτητα από τα κύτταρα στο ΕΝΥ, από τα 330 παιδιά που εξετάστηκαν, τα 75 (22,7%) είχαν λοίμωξη από EV και 6/330 (1,8%) λοίμωξη από HPeV. Η διάμεση ηλικία των παιδιών με λοίμωξη από EV στο ΚΝΣ ήταν 2 μήνες (IQR: 1–60) και 44/75 (58,7%) από αυτούς ήταν αγόρια. Υπήρχε μια εποχική κατανομή των λοιμώξεων του EV, με τα περισσότερα κρούσματα να ανιχνεύονται μεταξύ Ιουνίου και Σεπτεμβρίου (38/75,50,7%). Οι κυρίαρχοι γονότυποι EV ήταν CV-B5 (16/45, 35,6%), Ε30 (10/45, 22,2%), Ε16 (6/45, 13,3%) και Ε11 (5/45, 11,1%). Δεν ανευρέθηκαν ορότυποι EV που δεν έχουν δημοσιευθεί στο παρελθόν ή που σχετίζονται με ασυνήθιστες νευρολογικές εκδηλώσεις και όλα τα παιδιά ανάρρωσαν χωρίς εμφανή οξέα επακόλουθα. Όλες οι περιπτώσεις λοίμωξης με HPeV εντοπίστηκαν σε βρέφη κάτω των 3 μηνών, και σε αυτή την ηλικιακή ομάδα οι HPeV αντιπροσώπευαν το 11,6% (6/51) των περιπτώσεις ιογενούς μηνιγγίτιδας. Η διάμεση ηλικία των θετικών βρεφών για τον HPeV ήταν 0,6 μήνες (IQR: 0,5–1,6) και 83,3% (5/6) ήταν αγόρια. Τα νεογνά (6/6) παρουσίασαν εμπύρετη νόσο, 3/6 παρουσιάστηκαν με νόσο που ομοιάζει με σήψη, 3/6 με εξάνθημα και 1/6 με σπασμούς. Στα 3/6 νεογνά η εμπειρική αντιμικροβιακή αγωγή διακόπηκε μετά την ανίχνευση του HPeV ενώ το νεογνό με τη νόσο που ομοιάζει με σήψη έλαβε ενδοφλέβια γ- σφαιρίνη. Από τη γονοτύπηση αναδείχθησαν 3 ανασυνδυασμένα στελέχη HPeV που δεν είχαν δημοσιευθεί στο παρελθόν.
Συμπεράσματα: Στη μελέτη μας, η χρήση συνδρομικής πολυπλεκτικής PCR είχε σημαντικό όφελος στην κλινική αντιμετώπιση παιδιών με λοίμωξη από το ΚΝΣ όσον αφορά τη μείωση των χρησιμοποιούμενων αντιμικροβιακών φαρμάκων, τη συνολική διάρκεια και το κόστος νοσηλείας. Η μοριακή μελέτη των EVs και HPeVs έδωσε στοιχεία για την επιδημιολογία και γενετική δομή των γονοτύπων που κυκλοφορούν στη χώρα μας.
(EL)
Introduction: Central nervous system (CNS) infections are caused by bacteria, viruses, fungi and parasites and are a serious disease that can cause multiple and long-term consequences for the patient's health and even death. Early diagnosis and treatment can be crucial for the subsequent development of the patient's health. Molecular epidemiology data of CNS infections, especially viral ones, available for the pediatric population are limited.
Purpose: The aim of the present study was: 1) to investigate the importance of syndromic diagnosis for the rapid detection of CNS infections in children using multiplex PCR in cerebrospinal fluid (CSF). In addition, to what extent it can contribute to the reduction of antibiotic administration days, the reduction of hospitalization days as well as the reduction of hospitalization costs. 2) the molecular detection, genotyping and phylogenetic analysis of enterovirus and parechovirus strains associated with CNS infections or septic syndrome in children and neonates. In addition, the correlation of the genotype of the viruses with the clinical and epidemiological characteristics and the severity of the disease.
Patients and method: During the first period of the study, a prospective cohort study was carried out in previously healthy children 0-16 years old with clinical suspicion of meningitis or encephalitis who were hospitalized at the "Agia Sophia" Children's Hospital during the period 04/2018-04/2019. The study included children in whom, at the discretion of the attending physician, a CSF sample was obtained and > 15 cells/mm3 were found. CSF was tested with the multiplex PCR syndromic method for CNS infection FilmArray-ME which tests for the following microorganisms: CMV, Enterovirus, HSV 1/2, HHV-6, Η. parechovirus, VZV, Cryptococcus neoformans/gattii, E.coli K1, H.influenzae, L.monocytogenes, N. meningitidis, S. agalactiae (GBS), and S. pneumoniae. For each child screened by a syndromic diagnostic method, an age-matched control child was selected, whose CSF was tested by individual PCRs for specific microorganisms at the discretion of the attending physician. The CSF of all children was examined by standard microbiological methods. Final results compared between case and control group for outcome, length of hospital stay, duration of antimicrobial use, duration of acyclovir use, and total hospital cost. During the second period 5/2019-12/2021 of the study, all CSF samples of children with suspected CNS infection were tested with a syndromic diagnostic method of the CSF without limitation in relation to the number of cells in the CSF. In children whose CSF samples were found positive for enteroviruses (EV) or HpeV, stool and pharyngeal samples were collected and performed genotyping and phylogenetic analysis.
Results: The population of children who met the inclusion criteria for the cohort study was 142 children (71 in the syndromic diagnosis group). A pathogen was detected in 37/71 (52.1%) children using multiplex PCR and in 16/71 (22.5%) in the control group (P value < 0.001). In cases of aseptic meningitis, virus was detected in 27/61 (44.2%) and in 11/66 (16.7%) in the control group (P value < 0.001). Median length of stay in patients and controls with aseptic meningitis was 5 IQR (4-8) and 8 IQR (6-10) days, respectively (P value < 0.001). The median duration of antimicrobials in patients and controls was 4 IQR (2-5.7) and 7 IQR (5-10) days respectively (P value < 0.001). Hospitalization costs were estimated in patients and controls to be €1042 (932–1372) and €1522 (1302–1742), respectively (P value < 0.001). In the second period when all children were screened by multiplex PCR regardless of CSF cells,out of the 330 children tested, 75 (22.7%) had EV infection and 6/330 (1.8%) HPV infection. The median age of children with CNS EV infection was 2 months (IQR: 1–60) and 44/75 (58.7%) of them were boys. There was a seasonal distribution of EV infections, with most cases detected between June and September (38/75.50.7%). The predominant EV genotypes were CV-B5 (16/45, 35.6%), E30 (10/45, 22.2%), E16 (6/45, 13.3%), and E11 (5/45, 11 .1%). No previously unpublished EV serotypes associated with unusual neurologic manifestations were found, and all children recovered without apparent acute sequelae. All cases of HPeV infection were identified in infants under 3 months of age, and in this age group HPeV accounted for 11.6% (6/51) of cases of viral meningitis. The median age of HPeV-positive infants was 0.6 months (IQR: 0.5–1.6) and 83.3% (5/6) were boys. Neonates (6/6) presented with febrile illness, 3/6 presented with sepsis-like illness, 3/6 with rash, and 1/6 with convulsions. In 3/6 neonates empiric antibiotic treatment was discontinued after detection of HPeV while the neonate with sepsis-like disease received intravenous γ-globulin. Genotyping yielded 3 previously unpublished recombinant strains.
Conclusions: In conclusion, in our study, the use of syndromic multiplex PCR had a significant benefit in the clinical management of children with CNS infection in terms of the reduction of antimicrobial drugs used, the total duration and cost of hospitalization. The molecular study of EVs and HPeVs provided data on the epidemiology and genetic structure of the genotypes circulating in our country.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
