Το πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ), αν και θεωρείται μια σπάνια ασθένεια, είναι η δεύτερη πιο κοινή αιματολογική κακοήθεια και εντοπίζεται στο φάσμα των πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών. Σε αρκετές περιπτώσεις ξεκινάει από την μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (MGUS), και διέρχεται μέσω ενός ενδιάμεσου σταδίου που χαρακτηρίζεται ως έρπων πολλαπλό μυέλωμα (sMM). Η εξέλιξη της νόσου από τα καλοήθη πρόδρομα στάδια στο θανατηφόρο κακοήθες ΜΜ εξαρτάται από ένα σύμπλεγμα παραγόντων που δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητοί. Το χαρακτηριστικό ορόσημο αυτής της πάθησης είναι ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός των πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών, με αποτέλεσμα την παραγωγή και έκκριση μη λειτουργικών ανοσοσφαιρινών. Οι βελτιώσεις στη θεραπεία του ΜΜ τις τελευταίες δεκαετίες, ξεκινώντας από τη χρήση της μεταμόσχευσης αυτόλογων βλαστοκυττάρων που ακολουθήθηκε από τη διαθεσιμότητα των νέων θεραπειών όπως τα ανοσοτροποποιητικά φάρμακα (IMIDs) και οι αναστολείς πρωτεασώματος (PIs), έχουν μεταμορφώσει την ιστορία της νόσου οδηγώντας σε μεγαλύτερους χρόνους επιβίωσης. Παρόλα αυτά τα υψηλά ποσοστά υποτροπών και η εξαιρετικά ετερογενής ανταπόκριση στη θεραπεία παρεμποδίζει την αξιόπιστη πρόγνωση και την εξατομικευμένη θεραπευτική, υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη για την οριοθέτηση καινοτόμων προγνωστικών δεικτών που πρέπει να ενσωματωθούν στην κλινική περίθαλψη. Συνεπώς η εύρεση νέων μοριακών βιοδεικτών είναι επιτακτική ανάγκη για την βελτιστοποίηση της πρόγνωσης , της διάγνωσης και της επίβλεψης των ασθενών. Σε αυτό το πλαίσιο, οι τεχνικές υψηλής απόδοσης έχουν αποκαλύψει τα microRNAs, ως ισχυρούς μετα-μεταγραφικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης με κρίσιμες επιπτώσεις στην εμφάνιση και στην εξέλιξη του καρκίνου. Η εμφάνιση αυτών των τεχνικών αποκάλυψε ότι τα miRNAs απορρυθμίζονται σε όλους τους ανθρώπινους όγκους και ανέδειξαν τη χρησιμότητα τους ως πιθανούς προγνωστικούς δείκτες. Με βάση αυτά τα δεδομένα αποφασίσαμε για τους σκοπούς της παρούσας διπλωματικής εργασίας να ερευνήσουμε τα επίπεδα έκφρασης και την κλινική σημασία των microRNAs στο πολλαπλό μυέλωμα. Τα εν λόγο μόρια είναι μικρά μη κωδικά RNA μόρια, μήκους 19-25 νουκλεοτιδίων που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση προκαλώντας την αναστολή της μετάφρασης ή την πλήρη αποικοδόμηση των mRNA στόχων τους μέσω της συμπληρωματικότητας των βάσεων τους. Προσδένονται στη 3’-αμετάφραστη περιοχή (3’-UTR) των mRNA-στόχων μέσω μια αλληλουχίας 6-8 νουκλεοτιδίων (seed region) που έχουν κοντά στο 5’ άκρο τους.
Στο πλαίσιο αυτό, πραγματοποιήθηκε μια εκτενής βιβλιογραφική αναζήτηση για μόρια microRNA που έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται ενεργά στους καρκίνους και στοχεύουν ισχυρά γονίδια του κυτταρικού κύκλου. Επιλέχθηκαν τα miR-34a-5p, miR-106b-5p, miR-221-3p και miR-222-3p για τα οποία θελήσαμε να αναπτύξουμε ένα πρωτόκολλο in-house qPCR, με το οποίο θα ενισχύαμε ειδικά αυτά τα μόρια και θα μπορούσαν να ανιχνευθούν ποσοτικά. Παρόλου που έγινε βελτιστοποίηση και για τα 4 μόρια, επιλέχθηκαν μόνο τα miR-221-3p και miR-222-3p για περαιτέρω μελέτη στους ασθενείς. Χρησιμοποιήθηκε ένας στατιστικά ικανό πλήθος δειγμάτων (n=167), εκ των οποίων ήταν ΜΜ (n=130), με sMM (n=28) και με MGUS (n=9). Μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν από μυελό των οστών μέσω Ficoll-Paque, ενώ CD138+ πλασματοκύτταρα επιλέχθηκαν με μαγνητικό διαχωρισμό σωματιδίων συνδεδεμένων με ειδικά anti-CD138 mAbs. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA, πολυαδενυλίωση στο 3’-άκρο του και αντίστροφη μεταγραφή με χρήση oligo(dT)-adapter εκκινητή. Τα επίπεδα του miR-221-3p και miR-222-3p, ποσοτικοποιήθηκαν με in-house qPCR μεθοδολογία. Η ολική επιβίωση (OS), η επιβίωση-ελευθέρας εξέλιξης (PFS) και η επιβίωση σχετιζόμενη με τον καρκίνο, αξιοποιήθηκαν για την ανάλυση επιβίωσης και τη μετα-θεραπευτική παρακολούθηση των ασθενών. Τα αποτελέσματα που λάβαμε από την στατιστική ανάλυση παρουσίασαν ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Αρχικά τα επίπεδα του miR-221-3p ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς με ΜΜ σε σχέση με αυτούς με sMM/MGUS (p=0,030), γεγονός που υποδεικνύει ότι το μόριο αυτό μπορεί να λειτουργήσει δυνητικά ως πιθανός διαφοροδιαγνωστικός δείκτης. Επιπλέον τα χαμηλά επίπεδα του συγκεκριμένου μορίου συσχετίστηκαν στατιστικά σημαντικά με τα αυξημένα επίπεδα του διαγνωστικού δείκτη b2m (p=0,059) αλλά και με τη ικανότητα σταδιοποίησης των ασθενών καθώς ήταν σημαντικά μειωμένα στους ασθενείς που βρίσκονται στην RISS III σε σχέση με αυτούς που βρίσκονται στα RISS I/II (p=0,052). Επίσης το miR-221-3p θα μπορούσε να είναι ένας δείκτης για τη πρόγνωση της νόσου. Πιο συγκεκριμένα, τα μειωμένα επίπεδα του συσχετίστηκαν αρνητικά με την ολική επιβίωση (p=0,040) και με την επιβίωση των ασθενών χωρίς εξέλιξη της νόσου για το χρονικό διάστημα της μελέτης (p=0,003). Η ισχυρή αυτή προγνωστική αξία των επιπέδων του miR-221-3p επιβεβαιώθηκαν και από την ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox. Ομοίως για το miR-222-3p, τα επίπεδα του ήταν σημαντικά μειωμένα στους ασθενείς με υψηλές τιμές b2m (p=0,091) και στους ασθενείς ΜΜ που βρίσκονται στα στάδια RISS III έναντι των RISS I/II (p=0,036). Επιπλέον η ανάλυση επιβίωσης μέσω καμπυλών Kaplan-Meier υπογράμμισε τη στατιστικά σημαντική συσχέτιση των χαμηλών επιπέδων του μορίου με την ολική επιβίωση των ασθενών (p=0,015), την εξέλιξη της νόσου μετά από κάποιο θεραπευτικό πρωτόκολλο (p=0,004) και τους θανάτους από το συγκεκριμένο τύπο καρκίνου (p=0,022). Η ισχυρή προγνωστική αξία των επιπέδων του miR-222-3p για τους παραπάνω προγνωστικούς δείκτες επιβεβαιώθηκα με ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox. Συνολικά, το miR-221-3p θα μπορούσε να θεωρηθεί ως πιθανός διαφοροδιαγνωστικός δείκτης ανάμεσα σε ασθενείς με ΜΜ και sMM/MGUS, ενώ συγχρόνως τα χαμηλά επίπεδα τόσο του miR-221-3p και του miR-222-3p θα μπορούσαν να αποτελέσουν δυο δείκτες κακής προγνωστικής αξίας και ολικής επιβίωσης των ασθενών.
(EL)
Multiple myeloma (MM), although a rare disease, is the second most common hematological malignancy, which is in the spectrum of plasma cell dyscrasias. In several cases it starts from a benign stage, monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and progress through an intermediate stage characterized as smoldering myeloma (sMM). The progression of the disease from the benign precursor stages to the fatal malignant MM depends on a complex of factors that are not yet fully understood. The hallmark of this condition is the uncontrolled proliferation of plasma cells in the bone marrow, resulting in the production and secretion of non-functional immunoglobulins. In the last decades improvements in the treatment of MM, beginning with the use of Autologous Stem Cell transplantation and followed by the availability of new therapies such as immunomodulatory drugs (IMIDs) and proteasome inhibitors (PIs), have transformed the history of the disease leading to greater survival times. Despite these substantive advancements, the highly heterogenous treatment response and the high relapse levels hinders reliable prognosis and tailored therapeutics, highlighting the urgent need for the delineation of innovative prognostic markers to be incorporated into clinical care. In this context, high-throughput techniques have unveiled microRNAs (microRNAs), as potent post-transcriptional regulators of gene expression with critical implications in cancer onset and progression. The emergence of these techniques revealed that miRNAs are deregulated in all human tumors and highlighted their utility as potential prognostic indicators. Herein, based on these we decided for the purpose of this thesis to investigate the expression levels and clinical significance of microRNAs in multiple myeloma. The molecule in question are small non-coding RNA molecules, 19-25 nucleotides long that regulate gene expression by causing the inhibition of translation or the complete degradation of their target mRNAs through their base complementarity. They bind to 3’-untrasnlated region of their target mRNAs through a sequence of 6-8 nucleotides (seed region) located close to the 5’-end of the microRNA.
In this context, an extensive literature research was performed for microRNA molecules that have been shown to be actively involved in cancer progression and target potent crucial genes of cell cycle. Specifically, mir-34a-5p, miR-106b-5p, miR-221-3P and miR-222-3p were selected to develop an in-house qPCR protocol, by which we would specifically amplify these molecules and they could be quantitatively detected. Although all 4 molecules were optimized, miR-221-3p and miR-222-3p were selected for screening our cohort. A statistically satisfactory number of samples (n=167) were used, of which with MM (n=130), with smoldering multiple myeloma (n=28) and with monoclonal gammopathy of undetermined significance (n=9). Mononuclear cells were isolated from bone marrow using Ficoll-Paque, while CD138+ plasma cells were positively selected using magnetic beads with anti-CD138 mAbs. Then total RNA isolation, polyadenylation at its 3’end and reverse transcription using oligo (dT)-adapter was held. Subsequently the levels of mir-221-3p and miR-222-3p were quantified using an in-house qPCR methodology. To analyze survival and post-treatment follow-up of patients we used Overall Survival, Progression-free survival and Cancer-related Survival. The result we obtained from the statistical analysis were of particular interest. First, miR-221-3p levels were lower in patients with MM, in contrast with them, who have been diagnosed with sMM or MGUS (p=0,030). This factor indicate that this molecule can potentially function as a potential diagnostic marker to distinguish between sMM/MGUS and MM patients. Synchronously, the low levels of this molecule seem to be related with the upregulation of the levels of b2m (beta-2-microglobulin) (p=0,059), a prognostic marker for MM. Concurrently miR-221-3p levels were significantly reduced in patients at the stage of RISS III compared to those in RISS I/II (p=0,052). Furthermore, the downregulation of this microRNA could be an indicator for bad prognosis for MM. Low levels were negatively associated with total survival (p=0,040) and with the progression of the disease after a therapeutic protocol (p=0,003). The strong predictive value of miR-221-3p levels was also confirmed by Cox regression analysis. Along the same lines, we obtained significantly reduced levels of miR-222-3p in patients with high b2m values (p=0,091) and in MM patients in RISS III stage versus them in stages RISS I/II (p=0,036). In addition, survival analysis through Kaplan-Meier curves highlighted the statistically significant association of low levels of the miR-222-3p with overall patient survival (p=0,015), higher risk of short-term disease progression (p=0,004) and deaths from the specific type of cancer (p=0,022). The strong predictive value of miR-222-3p, in terms of disease progression and overall survival, was also confirmed by Cox regression analysis.
In conclusion, we identified the loss of miR-221-3p and miR-222-3p in CD138+ plasma cells as a powerful indicator of adverse disease outcome, ameliorating tailored patient’s management.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
