H εργασία αυτή στοχεύει στην συγκριτική μελέτη του επιγενετικού προφίλ μεσεγχυματικών
βλαστικών κυττάρων (DAF-MSCs) προερχόμενων μέσω αποδιαφοροποίησης από
αδιποκύτταρα (AL) χωρίς επαγόμενη έκφραση μεταγραφικών παραγόντων πολυδυναμίας, αλλά
μόνο με την καλλιέργεια τους σε μέσο καλλιέργειας μεσεγχυματικών κυττάρων αμνιακού υγρού
(AF-MSCs). Τα αδιποκύτταρα προήλθαν από διαφοροποίηση AF-MSCs δευτέρου τριμήνου σε
διάστημα δύο εβδομάδων. Η ανάλυση που ακολουθεί συγκρίνει τα επιγενετικά προφίλ των
AF-MSCs (AF), DAF-MSCs (DAF), και AL-Cells (AL) σειρών, χρησιμοποιώντας δεδομένα από
αλληλούχιση υπερευαισθησίας στην DNAse 1 (DHS).
Τα αποτελέσματα έδειξαν ποσοτική και λειτουργική ομοιότητα μεταξύ των DAF-MSCs και
AF-MSCs κυτταρικών σειρών, παρά την υψηλή ετερογένεια που παρουσιάζουν. Τα AL
παρουσιάζουν προφίλ παρόμοιο με αυτό των αδιποκυττάρων, με μερική έκφραση παραγόντων
πολυδυναμίας, που αποτελεί ένδειξη ατελούς διαφοροποίησης. Η σύγκριση των κορυφών κάθε
αλληλούχισης λειτουργικά, έδειξε ότι οι μοναδικές κορυφές των AL έχουν περισσότερους
υποκινητές από ότι στα DAF και AF (fc= 1.89 και 2.54 αντίστοιχα ), υποδηλώνοντας αυξημένη
μεταγραφική δραστηριότητα. Η ανάλυση των αλληλουχιών πρόσδεσης μεταγραφικών
παραγόντων (motif enrichment) στις κορυφές του κάθε πειράματος έδειξε ότι η ομάδα AP1
(activator protein 1), σχετιζόμενη με βλαστικά κύτταρα, ήταν ενισχυμένη (υψηλή συχνότητα
μοτίβου) στα AF συγκριτικά με τις άλλες σειρές (log2fc=1.9), με το μοτίβο εντονότερο στα AL
από ό,τι στα DAF. Στα AL εμφανίστηκε υψηλότερη ενίσχυση του μοτίβου του μεταγραφικού
παράγοντα CEBPα (log2fc=1.5), βασικού ρυθμιστή της αδιπογένεσης. Στα DAF περιορισμένος
αριθμός μοτίβων ξεχώρισαν, καθώς η συχνότητα και η στατιστική σημαντικότητα είναι συγκριτικά
χαμηλή. Σημαντική ενίσχυση παρατηρήθηκε σε μοτίβα του κύριου μεταγραφικού παράγοντα
αποδιαφοροποίησης, OCT4, τόσο στα AF όσο και στα DAF συγκριτικά με τα AL (log2fc=1.2 και
0.8 αντίστοιχα), ενώ συγκριτικά με τα AF τα DAF παρουσίασαν σημαντική ενίσχυση για μοτίβα
του CEBPα (log2fc=0.72). Χρησιμοποιώντας τα αποτυπώματα μεταγραφικών παραγόντων
(footprints), η εικόνα είναι παρόμοια, με την διαφορά ότι το μοτίβο AP1 είναι πιο έντονο στα DAF
από ό,τι στα AL (log2fc=0.47), και την ενίσχυση της συχνότητας μοτίβου του SOX2 στα ΑL
(log2fc=0.6).
Η διαφορική προσβασιμότητα των υποκινητών έδειξε ότι η προσβασιμότητα είναι λιγότερο
διαφορετική στους υποκινητές των AF - DAF από ό,τι μεταξύ AL - DAF. Συγκεκριμένα, μόνο το
3.27% των υποκινητών είχε στατιστικά σημαντική διαφορά προσβασιμότητας μεταξύ AF και
DAF, ενώ το ποσοστό αυτό ήταν 25.4% μεταξύ AL και DAF. Η μελέτη των μονοπατιών για τους
διαφορικά προσβάσιμους υποκινητές ανέδειξε την πολυδυναμία των AF-MSC, τη διαφοροποίηση των αδιποκυττάρων και τον ενδιάμεσο φαινότυπο των DAF. Ξεχωρίζουν τα
ευρήματα του ενζύμου HSD11B1 που καταλύει την παραγωγή κορτιζόλης (AL>>DAF>AF), του
μεταγραφικού παράγοντα ZBTB16 (ΑL>>DAF>AF), που συμβάλλει στην αναδιαμόρφωση της
χρωματίνης, και της ορμόνης ενεργειακού στρές ANGPTL4. Αντίστοιχη ανάλυση στα γονίδια
ανέδειξε διαφορετικές πρωτεΐνες στα AL αλλά πάλι σχετικές με την αντιμετώπιση του στρες και
την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, όπως και η διαφορική προσβασιμότητα στους ενισχυτές,
με δείκτες αδιπογένεσης να εντοπίζονται στις περισσότερες συγκρίσεις.
Συνολικά, η ατελής διαφοροποίηση, το μεταβολικό στρες και η δράση παραγόντων που
προωθούν την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, ενδέχεται να εξηγούν την παρατηρούμενη
αποδιαφοροποίηση. Τα AL φαίνεται να είναι το κλειδί για την κατανόηση της διαδικασίας καθώς
παρουσιάζουν τις περισσότερες στατιστικά σημαντικές διαφορές στην προσβασιμότητα,
αναδεικνύοντας έντονη δραστηριότητα σε επιγενετικές αλλαγές που σε συνδυασμό με την
αλλαγή του καλλιεργητικού μέσου προκάλεσαν έντονες μεταβολικές αλλαγές οι οποίες είχαν
θετική ανάδραση στις επιγενετικές αλλαγές και την παρατηρούμενη αποδιαφοροποίηση.
(EL)
The present thesis focuses on the epigenetic profile of adipocyte-like cells (AL cells) derived
from amniotic fluid mesenchymal stem cells (AF-MSCs) that can dedifferentiate into a distinct
cell line, termed DAF-MSCs, regaining a phenotypic and proteomic profile resembling the
original AF-MSCs when cultured in standard AF-MSC medium. Here, we show that DAF-MSCs
(DAF) and AF-MSCs (AF) exhibit a strikingly similar chromatin accessibility profile compared to
AL cells (AL).
Dnase I hypersensitivity sequencing revealed a significantly lower number of differentially
accessible promoters, genes, and enhancers between AF and DAF than between AL and DAF
or AL and AF. Genomic feature analysis of accessible regions (peaks) indicated an intermediate
phenotype for DAF, while AL exhibited a higher promoter count, suggesting increased metabolic
activity (0.028% AL, 0.011% AF, 0.015% DAF, promoters). Motif enrichment analysis of
footprints and peaks identified adipocyte-related transcription factors in AL and predominantly
stem cell-related factors in AF and DAF.
Intriguingly, Oct4 and Sox2 motifs were enriched (higher motif frequency) in both AF and DAF
compared to AL (log2fc=0.8 for AF, 0.7 for DAF, 0.6 for AL, for the oct4+sox2 combined motif),
along with the Lin54 motif (log2fc = 1.2, 0.8, 0.6), typically associated with induced pluripotent
stem cells (iPSCs). Unlike iPSCs, AF displayed a strong enrichment of the AP1/1 motif,
characteristic of MSCs, less apparent on DAF and AL (log2fc = 1.9, 0, 0.2). This motif includes
factors like c-Jun, known to inhibit pluripotency reprogramming. The Cebp family was the driver
of adipogenesis in AL, as evidenced by high motif enrichment and accessibility of related genes
and enhancers (motif log2fc = 1.5, gene and enhancer fc ~2 with p-value < 0.05).
DAF exhibited an intermediate motif frequency profile between AF and AL. While Oct4 promoter
and gene accessibility aligned with the AF and DAF profile, Sox2, Myc, and Klf4 accessibility
was higher in AL, with Myc being significantly increased (Myc: AL/AF log2fc=0.92, p-value<0.05,
AL/DAF log2fc=1.22 q-value<0.05. Klf4: AL/DAF log2fc=0.99 p-value<0.05). Analysis of
differentially accessible promoters revealed adipocyte, stress, and chromatin remodeling-related
genes. Notably, ZBTB16, ANGPTL4, HSD11B1, and IGF2 were hyperaccessible in AL,
indicating chromatin remodeling, metabolic reprogramming, and intense stress response mostly
energy-related.
Importantly, many key adipocyte markers such as ADIPOQ, or preadipocyte-specific markers
such as DLK1, did not exhibit increased accessibility in AL. These findings suggest that DAF
dedifferentiation is reflected at the epigenetic level, with DAF displaying an intermediate profile
with a closer resemblance to AF. The observed atypical dedifferentiation appears to result from
partial AL differentiation combined with a dedifferentiation-promoting environment characterized
by heightened chromatin remodeling, metabolic reprogramming, and stress response.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
