Η προχωρημένη ηλικία είναι ο ισχυρότερος προγνωστικός παράγοντας για τη μετάβαση της Σκλήρυνσης Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) από τη φάση της Διαλείπουσας-Υποτροπιάζουσας (RR-MS) στη Προοδευτική μορφή της νόσου (P-MS), οδηγώντας στην ανάπτυξη μη αναστρέψιμης αναπηρίας. Σε αυτή την κατεύθυνση, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο τρόπος με τον οποίο η γήρανση επηρεάζει τη μικρογλοία σε ένα in vivo πειραματικό μοντέλο Προοδευτικής ΣΚΠ σε ποντίκια, βασισμένο στην απομυελίνωση που προκαλείται από τη χορήγηση της τοξίνης cuprizone και στη συνέχεια τη διακοπή της, με στόχο την επίτευξη της επαναμυελίνωσης. Η μελέτη επικεντρώθηκε στη λευκή ουσία του εγκεφάλου, συγκεκριμένα στο Μεσολόβιο (Corpus Callosum, CC) και στις γειτονικές ανατομικές περιοχές: Ραχιαίο Ιπποκάμπειο Σύνδεσμο (Dorsal Hippocampal Commissure, DHC) και alveus (alv), δεδομένης της λειτουργικής τους σημασίας για το ΚΝΣ. Στο πλαίσιο αυτό, εξετάστηκε η οδός φαγοκυττάρωσης της μυελίνης από τα μικρογλοιακά κύτταρα, η οποία περιλαμβάνει την πέψη των καταλοίπων-υπολειμμάτων της μυελίνης για τον σχηματισμό οργανιδίων αποθήκευσης που ονομάζονται Λιπιδικά Σταγονίδια (Lipid Droplets, LDs), προκειμένου να αποτραπεί η λιποτοξικότητα και το οξειδωτικό στρες, που προκαλείται από τα ελεύθερα λιπίδια, ποσοτικοποιώντας το λυσοσωμικό stress που προκύπτει από αυτή τη διαδικασία μέσω της χρώσης SA-β-gal. Η υπερβολική συσσώρευση Λιπιδικών Σταγονιδίων (LDs) οδηγεί σε υποξία, stress του ενδοπλασματικού δικτύου (ER stress), διήθηση ανοσοκυττάρων και αυξημένη έκκριση προφλεγμονωδών κυτταροκινών, ενώ ταυτόχρονα περιορίζει την εκροή και ανακύκλωση των λιπιδίων (lipid efflux-recycling), που θα υποστήριζε την επαναμυελίνωση από τα ολιγοδενδροκύτταρα. Έτσι, η λειτουργικότητα της οδού αποδόμησης των LDs, που πραγματοποιείται μέσω της κυτταροπλασματικής λιπόλυσης και της λιποφαγίας (οδός αυτοφαγίας για τα λιπίδια), μελετήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας τη χρώση Oil Red O για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των LDs. Από το in vivo πείραμα, παρατηρήθηκε ότι τα ηλικιωμένα/γηρασμένα ποντίκια παρουσιάζουν καθυστέρηση στον πολλαπλασιασμό-ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων, καθώς και στην ικανότητά τους να πραγματοποιούν φαγοκυττάρωση, με αποτέλεσμα αντίστοιχη καθυστέρηση και στη διαδικασία απομυελίνωσης στις 4 εβδομάδες από την έναρξη της χορήγησης cuprizone (CPZ4), σε αντίθεση με τα νεαρά ποντίκια, στα οποία αυτές οι διαδικασίες έχουν προχωρήσει σε αυτό το χρονικό σημείο. Στα ηλικιωμένα/γηρασμένα ποντίκια, η διαδικασία φαγοκυττάρωσης-απομυελίνωσης προωθείται στις 6 εβδομάδες από την έναρξη της χορήγησης cuprizone (CPZ6), χρονικό σημείο στο οποίο το υψηλό σήμα Oil Red O-συσσώρευση LDs υποδεικνύει παράλληλα την αδυναμία των ηλικιωμένων/γηρασμένων μικρογλοιακών κυττάρων να μεταβολίσουν τα LDs τόσο αποτελεσματικά, όσο τα νεαρά ποντίκια στο CPZ4. Όσον αφορά τη διαδικασία επαναμυελίνωσης, εξετάστηκε ένα χρονικό σημείο 4 εβδομάδων μετά τη διακοπή της χορήγησης cuprizone (CPZ6+4), καταδεικνύοντας ότι στα νεαρά ποντίκια η επίλυση της μικρογλοίωσης, η αποδόμηση-εκκαθάριση των LDs, και η επαναμυελίνωση έχουν σε μεγάλο βαθμό ολοκληρωθεί. Αντίθετα, τα ηλικιωμένα/γηρασμένα ποντίκια παρουσιάζουν ιδιαίτερα έντονη και ανεπίλυτη συσσώρευση LDs, η αποδόμηση των οποίων δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί αποτελεσματικά, εμποδίζοντας περαιτέρω την απομάκρυνση των μυελινικών καταλοίπων-υπολειμμάτων, και κατά συνέπεια, οδηγώντας σε αναστολή της επαναμυελίνωσης. Συμπερασματικά, η συσσώρευση LDs συμπίπτει με τη διαδικασία απομυελίνωσης και φαίνεται να εμποδίζει την επαναμυελίνωση. Επιπλέον, επιχειρήθηκε και μια πιο μηχανιστική προσέγγιση των εξεταζόμενων διαδικασιών στο πλαίσιο αυτής της μελέτης και, ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκαν in vitro πειράματα για να διερευνηθεί η επίδραση της γήρανσης στην ικανότητα των περιτοναϊκών μακροφάγων να φαγοκυτταρώνουν μυελίνη (φαγοκυτταρική οδός), να αποδομούν τα σχηματισμένα LDs που προκύπτουν από την πέψη της μυελίνης (λιποφαγική οδός), καθώς και την επακόλουθη επίδραση της συσσώρευσης των LDs στην ικανότητά τους να φαγοκυτταρώνουν νέα μυελίνη. Σε αυτή τη βάση, τα in vitro πειράματα επιβεβαίωσαν μερικά από τα αποτελέσματα των in vivo πειραμάτων μας. Συγκεκριμένα, καταγράφηκε ότι τα περιτοναϊκά μακροφάγα, που απομονώθηκαν από ηλικιωμένα/γηρασμένα ποντίκια και καλλιεργήθηκαν, παρουσίασαν καθυστέρηση στη φαγοκυττάρωση της μυελίνης, κατά τη διέγερσή τους για διαφορετικά χρονικά σημεία, αλλά τελικά απέκτησαν ικανότητα φαγοκυττάρωσης σε επίπεδα συγκρίσιμα με αυτά των νεαρών ποντικών. Επιπλέον, μετά από τη διέγερση των περιτοναϊκών μακροφάγων -τόσο νεαρών, όσο και ηλικιωμένων- με μυελίνη για 16 ώρες, ακολουθούμενη από έκπλυση (washout), και καλλιέργεια τους σε θρεπτικό μέσο χωρίς μυελίνη, για 24 και 48 ώρες, παρατηρήθηκε ότι τα γηρασμένα μακροφάγα είχαν συσσωρεύσει περισσότερα LDs, σε σχέση με τα νεαρά, και στα δύο αυτά χρονικά σημεία. Το γεγονός αυτό αντικατοπτρίζει τη μειωμένη ικανότητά των γηρασμένων μακροφάγων για αποδόμηση των LDs, υποδηλώνοντας τη μειωμένη αποτελεσματικότητα της οδού αυτοφαγίας-λιποφαγίας. Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων, θεωρήθηκε πολύ σημαντικός και διερευνήθηκε και ο ρόλος της φαρμακολογικής ουσίας ραπαμυκίνης στις προαναφερόμενες διαδικασίες, η οποία ένας αναστολέας της σηματοδοτικής οδού mTOR, και θα μπορούσε έτσι να προάγει τη διαδικασία της αυτοφαγίας, αποτελώντας έναν δυνητικό θεραπευτικό παράγοντα.
Συντομογραφίες: CPZ4, 4 εβδομάδες από την έναρξη της χορήγησης cuprizone; CPZ6, 6 εβδομάδες από την έναρξη της χορήγησης cuprizone; CPZ6+4, 4 εβδομάδες μετά τη διακοπή του cuprizone, που είχε χορηγηθεί για 6 εβδομάδες
(EL)
Advanced age is the strongest predictive factor for the transition of MS from the relapsing-remitting phase (RRMS) to the progressive form of the disease (PMS), leading to the development of irreversible disability. In this direction, the present thesis studied the mechanism by which aging affects microglia in an in vivo experimental model of progressive MS in mice based on cuprizone-induced demyelination and subsequent cessation, aiming to achieve remyelination. The study focused on the white matter, specifically the corpus callosum (cc), and adjacent anatomical areas: the dorsal hippocampal commissure (dhc) and alveus (alv), given their functional significance for the CNS. In this context, the phagocytic pathway of myelin by microglial cells was examined, involving the digestion of myelin debris to form storage organelles named Lipid Droplets (LDs) in order to prevent lipotoxicity and oxidative stress of free lipids, quantifying the lysosomal stress resulting from this process through SA-b-gal staining. Excessive lipid droplet accumulation leads to hypoxia, ER stress, immune cell infiltration and increased secretion of proinflammatory cytokines, while simultaneously limits lipid efflux, that would subsequently support the remyelination process by oligodendrocytes. Thus, the functionality of the Lipid Droplet breakdown pathway, which occurs through cytoplasmic lipolysis and lipophagy (autophagy pathway for lipids), was also studied using Oil Red O staining for LDs detection and quantification. From the in vivo experiment, it was observed that aged mice exhibit a delay in the proliferation-activation of microglial cells, as well as in their ability to perform phagocytosis, resulting in a corresponding delay in the demyelination process at 4 weeks from the onset of cuprizone administration (CPZ4), unlike young mice in which these processes have progressed at this time point. In aged mice, the phagocytosis - demyelination process progresses at 6 weeks of cuprizone administration (CPZ6), a time point at which the high Oil Red signal-LDs accumulation indicates the inability of aged microglial cells to metabolize LDs as efficiently as young mice at CPZ4. Regarding the remyelination process, a time point 4 weeks after the cessation of cuprizone administration (CPZ6+4) was examined, showing that in young mice the resolution of microgliosis, LDs degradation and remyelination have been largely completed. Conversely, aged mice exhibit particularly acute and unresolved LDs accumulation, the degradation of which cannot be efficiently performed, resulting in further obstruction of myelin debris clearance and, consequently, inhibition of remyelination. In conclusion, LDs accumulation coincides with the demyelination process and appears to hinder remyelination. Additionally, a more mechanistic approach to the examined processes was attempted within the framework of this study, and therefore, in vitro experiments were conducted to investigate the effect of aging on the ability of peritoneal macrophages to phagocytose myelin (phagocytic pathway), degrade the formed LDs resulting from myelin digestion (lipophagic pathway), as well as the subsequent effect of LDs accumulation on their ability to phagocytose new myelin. On this basis, the In Vitro Experiments confirmed some of our In Vivo results. Specifically, it was recorded that peritoneal macrophages, isolated from aged mice and cultured, displayed a delay in phagocytosing myelin, they were stimulated by for different time points, but eventually, they acquired phagocytic ability at levels comparable to young mice. Furthermore, after stimulating peritoneal macrophages - both young and aged - with myelin for 16 hours followed by a washout and culturing them in media without myelin for 24 and 48 hours, it was observed that aged macrophages had accumulated more LDs compared to young ones in both time points. This reflects their reduced ability for LDs degradation, implying the diminished effectiveness of the autophagy-lipophagy pathway. Based on these findings, the role of the pharmacological factor rapamycin in the aforementioned processes was deemed highly significant and further investigated. Rapamycin, being an inhibitor of the mTOR signaling pathway, could potentially promote the process of autophagy, making it a potential therapeutic agent.
Abbreviations: CPZ4, 4 weeks from the onset of cuprizone administration; CPZ6, 6 weeks from the onset of cuprizone administration; CPZ6+4, 4 weeks after the cessation of cuprizone administration following 6 weeks of cuprizone administration
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
