Το WD40 μοτίβο αποτελεί ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα μοτίβα του
πρωτεώματος των ευκαρυωτικών οργανισμών, ενώ σπάνια εντοπίζεται στους
προκαρυωτικούς. Η ικανότητα των πρωτεϊνών που περιέχουν WD40 επαναλήψεις να
αναδιπλώνονται σε τριτοταγή δομή β-προπέλας, τις καθιστά άψογα ικριώματα για
πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Ωστόσο, η απουσία συντήρησης της αλληλουχίας,
εκτός των διπεπτιδίων υπογραφής, καθώς και η ταυτόχρονη εμπλοκή τους σε πολλά
διαφορετικά σύμπλοκα, καθιστά την ανεύρεση και μελέτη των WD40 πρωτεϊνών μία
εξαιρετικά δύσκολη διαδικασία.
Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο χαρακτηρισμός του γονιδίου
AtULCS1 (Ubiquitin Ligase Complex Subunit 1) τουArabidopsis thaliana και η
εύρεση του ρόλη της WD40 πρωτεΐνης που κωδικοποιεί. Το γονίδιο εδράζεται στο
πέμπτο χρωμόσωμα του Arabidopsis, στο γενετικό τόπο 66240 και η πρωτεΐνη που
παράγει αποτελείται από 331 αμινοξέα. Σύμφωνα με τη συγκριτική μελέτη των Lee
και συνεργατών του (2008) αποτελεί πιθανή υπομονάδα ενός Ε3 Cullin-RING
συμπλόκου λιγάσης, ενώ εμφανίζει μεγάλο ποσοστό αμινοξικής ταυτότητας με μία
ομόλογη πρωτεΐνη στο πρωτέωμα του Arabidospsis, την AtAPRF1. Παρά τη μεγάλη
ομοιότητάς τους, δεδομένα από τη λειτουργική ανάλυση των δύο πρωτεϊνών (παρούσα
μελέτη και αδημοσίευτα αποτελέσματα) υποδεικνύουν ότι συμμετέχουν σε δύο
διακριτά σύμπλοκα. Η AtULCS1, όπως αποκαλύπτουν τα αποτελέσματα της
συγκεκριμένης εργασίας, αλληλεπιδρά in planta με την DDB1a υπομονάδα,
δημιουργώντας ένα λειτουργικό σύμπλοκο CUL4-DDB1aAtULCS1 του πρωτεολυτικού
μονοπατιού, ρυθμίζοντας βασικές κυτταρικές διεργασίες. Αντίθετα, η ομόλογη
AtAPRF1, εμπλέκεται στη ρύθμιση του χρόνου άνθησης στο Arabidopsis, πιθανά μέσω
μεθυλίωσης του γενετικού τόπου FLC.
Κατά την πειραματική προσέγγιση της λειτουργικής ανάλυσης του γονιδίου,
πραγματοποιήθηκε η in silico ανάλυση του AtULCS1 όσο και της πρωτεΐνης που
κωδικοποιεί, ενώ ταυτόχρονα μελετήθηκε και η φυλογένεση της. Από την ανάλυση
αυτή, διαπιστώθηκε η ύπαρξη δύο ομόλογων αλληλουχιών σε όλους τους φυτικούς
οργανισμούς που ελέγχθηκαν. Αυτές οργανώνονται σε δύο διακριτούς κλάδους,
διαφορετικούς από αυτόν των μυκήτων και των ζώων. Η πρωτεΐνη AtULCS1
εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων, όπως
αποκαλύπτουν τα αποτελέσματα του υποκυτταρικού εντοπισμού της, ενώ αλληλεπιδρά
in planta ειδικά με την DDB1a υπομονάδα του συμπλόκου Ε3 λιγάσης. Η μελέτη του
ιστοειδικού προτύπου του γονιδίου, μέσω της δημιουργίας διαγονιδιακών σειρών
μεταγραφικής σύντηξης του υποκινητή με το γονίδιο αναφοράς της β-
γλυκουρονιδάσης (GUS), υπέδειξε την έκφραση του σε πολλά αναπτυξιακά στάδια, με
μέγιστη έκφραση στους ιστούς του άνθους. Επιπρόσθετα, δημιουργήθηκαν και
αναλύθηκαν σε μοριακό και φαινοτυπικό επίπεδο διαγονιδιακές σειρές RNAi
αποσιώπησης, καθώς και υπερέκφρασης του γονιδίου, οι οποίες αποκάλυψαν την
εμπλοκή του AtULCS1 γονιδίου σε μία πληθώρα αναπτυξιακών διεργασιών, με
σημαντικότερη την εναπόθεση δευτερογενών τοιχωμάτων στους ιστούς του ενδοθηκίου
και του αγωγού ιστού του βλαστού. Τέλος, όσον αφορά το μοριακό μονοπάτι στο
οποίο συμμετέχει, τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι εμπλέκεται στη ρύθμίση βασικών
ΜΥΒ μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι ελέγχουν την ενεργοποίηση ή καταστολή
γονιδίων των βιοσυνθετικών μονοπατιών της λιγνίνης και κυτταρίνης.
(EL)
The WD40 motif, or beta-transducin repeat (WDR), is considered one of the most
abundant domains among the eukaryotic proteins, while it is rarely found in
bacteria. The ability of WD40 proteins to fold into a tertiaryβ-propeller
architecture has made them excellent scaffolds for protein-protein and
protein-DNA interactions. The diversity within the WD40 sequence of WDR
proteins enables them to assemble a vast number of distinct multi-protein
complexes. Due to the low conservation rate of WDR repeats, the identification
and characterization of WD40 proteins is an extremely difficult procedure.
The aim of this PhD thesis was to characterize AtULCS1(Ubiquitin Ligase
Complex Subunit 1) gene of Arabidopsis thaliana that encodes for a novel WD40
protein. AtULCS1 consists of 331 amino acids and contains five WD40 repeats
that form the structural WD40 region of the protein. In a massive in silico
analysis in Arabidopsis proteome, AtULCS1 was annotated as a putative subunit
of an E3 Cullin-Ring Ligase (CRL) complex.
During the phylogenetic analysis of the protein, we identified two homologous
amino-acid sequences in all plant species checked that are organized in two
distinct clades of the phylogenetic tree. Arabidopsis proteome contains two
homologous proteins, AtULCS1 and AtAPRF1, which share a high percentage of
identity in their amino acid sequence. However, our data (PhD thesis and
unpublished data) supports the involvement of the two proteins in distinct
complexes. AtULCS1 interacts in planta with DDB1a, the protein subunit of DWD
E3 CRL complexes, and regulates a variety of cellular and developmental
processes through the proteolytic machinery. On the other hand, AtAPRF1 is
suggested to control flowering time in Arabidopsis possibly through methylation
of FLC genetic locus (Kapolas et al., 2016).
To obtain insights into the tissue specific expression pattern, Arabidopsis
transgenic plants harboring a promoter-GUS transcriptional fusion construct,
were analyzed. The aforementioned analysis showed the activity of AtULCS1
during a variety of developmental stages and its maximum expression in flower
tissues. The localization of AtULCS1 in both nucleus and cytoplasm in
Nicotianabenthamianaepidermic cells implies the assembly of both nuclear and
cytoplasmic E3 CRL complexes.
An RNAi mediated silencing and overexpression approach was used here to
functionally characterize the AtULCS1 gene. Detailed phenotypic analysis of the
ulcs1i transgenic lines revealed the involvement of the protein in a variety of
developmental processes such as seed size regulation, cell proliferation and
differentiation, plant growth and secondary wall modification. The partial
inability of ulcs1i mutants to deposit cellulose and lignin in anther
endothecium cells leads to a sterile phenotype due to anther indehiscence.
Moreover ulcs1i plants exhibit lower secondary thickening levels in the
vascular tissue of the shoot, suggesting a functional role of the gene during
the secondary wall modification pattern of the plants. Concerning the molecular
mode of action of AtULCS1 during cell thickening, our data indicate that it
possibly regulates the expression of several MYB transcription factors that act
as “master switches” during this process. This, results into the disturbance of
the expression levels of several IRX biosynthetic genes and finally to lower
secondary wall modification of endothecium and vascular xylem cells.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
