Οι πρωτεΐνες FOXO αποτελούν μέλη μιας μεγάλης οικογένειας πρωτεϊνών (Forkhead box-FOX) που χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας συντηρημένης περιοχής που συνδέεται με το DNA, και ταξινομούνται βάσει ομοιότητας από FOXA έως FOXR. Οι FOXO αποτελούν σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες για τα κύτταρα, καθώς έχουν συνδεθεί με ρύθμιση σημαντικών λειτουργιών εντός του κυττάρου όπως η παύση του κυτταρικού κύκλου και η απόπτωση. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) και μη-λευχαιμικών δοτών και αναζητήσαμε με μέθοδο ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο [real-time quantitative PCR (qPCR)] πιθανή έκφραση των mRNAs των γονιδίων αυτών σε cDNA, ενώ ακολούθησε και σχετική ποσοτικοποίησή τους με την μέθοδο σύγκρισης Ct 2-ΔΔCt. Αρχικά σχηματίσαμε θετικούς μάρτυρες για το κάθε FOXO και κατάλληλους εκκινητές. Έπειτα αφού ελέγξαμε πως προκύπτουν τα σωστά και μοναδικά προϊόντα, προχωρήσαμε στον σχηματισμό καμπυλών ποσοτικοποίησης για κάθε FOXO, με εξαίρεση το FOXO6. Για την μέθοδο ποσοτικοποίησης απαιτείται και ένα γονίδιο αναφοράς και μία καμπύλη ποσοτικοποίησης για αυτό, στην εργασία μας αυτό ήταν το γονίδιο GAPDH. Στην συνέχεια απομονώσαμε τα ολικά RNA από τα δείγματα και την κυτταρική σειρά EHEB, η οποία και αποτέλεσε τον εξισορροπιστή για την μέθοδο σύγκρισης. Αφού ελέγχθηκε η επιτυχία της απομόνωσης του RNA, ακολούθησε PCR αντίστροφης μεταγραφής με εκκινητές οligo(dT) που προσδένονται στην polyA ουρά των mRNA. Αμέσως μετά αφού ελέγχθηκε η επιτυχία της αντίστροφης μεταγραφής προχωρήσαμε στην διενέργεια ποσοτικής PCR στα δείγματα και την κυτταρική σειρά EHEB. Για την διενέργειά της, χρησιμοποιήθηκε η χρωστική SYBR Green. Έπειτα από έναν αρχικό έλεγχο μόνο η FOXO1 είχε σημαντική έκφραση. Στα αποτελέσματα μας, είδαμε υψηλά ποσοστά θετικότητας 79,2% με 80 στα 101 δείγματα να βρίσκονται θετικά, αλλά και έκφραση σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή της κυτταρικής σειράς EHEB. Ακόμη έπειτα από την σύγκριση της έκφρασης μεταξύ ασθενών με ΧΛΛ και των μη λευχαιμικών ατόμων, βρέθηκε πως στην υποομάδα των ασθενών με μη φυσιολογική LDH, η υψηλή έκφραση FOXO1 συσχετιζόταν με μικρότερους χρόνους επιβίωσης σε σχέση με αυτούς με χαμηλή FOXO1. Η παραπάνω συσχέτιση βρέθηκε στατιστικά σημαντική (p=0,001). Σε πρόσφατες έρευνες βρέθηκε συσχετισμός μεταξύ υψηλής έκφρασης του FOXO1 και κακής πρόγνωσης για την πορεία της ασθένειας, αλλά και αποκλεισμός της πρωτεΐνης έξω από τον πυρήνα του κυττάρου. Λαμβάνοντας τα παραπάνω υπόψιν, θεωρούμε πως περαιτέρω έρευνα απαιτείται ώστε να διευκρινιστεί εάν υπάρχουν πιθανοί ρόλοι του FOXO1 ως θεραπευτικός παράγοντας ή και αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ασφάλεια για την πρόγνωση της πορείας της ΧΛΛ
(EL)
FOXO proteins are members of a large protein family (Forkhead box-FOX) characterized by the presence of a conserved DNA-binding domain and are classified by similarity from FOXA to FOXR. FOXOs are important transcription factors for cells. They have been linked to the regulation of important functions within the cell, such as cell cycle arrest, and apoptosis. In the present work, we studied the expression of FOXOs mRNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) and non-leukemic donors using real-time quantitative PCR (qPCR), and we conducted relative quantification by using the 2-ΔΔCt method. Firstly, we constructed positive controls, and designed proper primers for each FOXO. Afterwards, we confirmed that the produced products were correct and unique. Then we constructed quantification curves for every FOXO, besides FOXO6. For the quantification method that we applied, it’s necessary to use a housekeeping gene and develop one quantification curve for it too. In our experiments GAPDH was the housekeeping gene. After we isolated the total RNA from the human samples and EHEB cell line. The EHEB cell line was used as a calibrator for the quantification. cDNAs were generated by reverse transcription using oligo(dT) primers annealed to the polyA tail of the mRNAs. Whereupon we carried out the Quantification PCR for the human samples and EHEB cell line. SYBR Green was used to perform qPCR. Of all the FOXOs that we tested, only FOXO1 was expressed at a significant level. Our results showed high positivity rates of 79.2% with 80 out of 101 samples being positive, and expression significantly higher than that of the EHEB cell line. Also, in the subgroup of patients with abnormal LDH, coexistence of high FOXO1 expression was correlated to poorer OS time in comparison with the patients with low FOXO1 expression (p = 0.001). In the current literature, a correlation was found between high FOXO1 expression and a poor prognosis for the course of the disease, but also the exclusion of the protein outside the cell nucleus. Taking the above into consideration, we believe that further research should clarify whether there are possible roles of FOXO1 as a therapeutic agent or whether it can be safely used to predict the course of CLL.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
