Η ηπατίτιδα C αποτελεί σημαντικό πρόβλημα υγείας που προσβάλλει περίπου 1,5 εκατομμύρια νέα άτομα το χρόνο παγκοσμίως, μετρώντας συνολικά 70 εκατομμύρια χρόνιους ασθενείς. Ο ιός που την προκαλεί, ο Ηepatitis C virus (HCV), μπορεί να οδηγήσει σε οξεία ή χρόνια λοίμωξη, η οποία κυμαίνεται από ήπια έως σοβαρή, καταλήγοντας συχνά σε επίμονη φλεγμονή, στεάτωση, ίνωση, κίρρωση του ήπατος, ακόμα και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ). Τελευταίες εξελίξεις στην αντιική θεραπεία με τα αντιικά άμεσης δράσης (direct acting antivirals, DAAs) οδηγούν σε εκρίζωση του ιού σχεδόν στο 95% των ασθενών. Ωστόσο, σε περιπτώσεις κιρρωτικών ασθενών με δεκαετίες έκθεσης στο ιό, δεν μηδενίζεται η πιθανότητα για εμφάνιση ΗΚΚ ή η αναζωπύρωση της νόσου. Ο ιός αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες του ξενιστή, αφήνοντας επιγενετικό, μεταβολικό και ανοσολογικό αποτύπωμα. Μεταξύ άλλων, ο HCV ρυθμίζει τη δράση του επιγενετικού παράγοντα LSD1 και επιδρά σε μεταστατικά μονοπάτια όπως η αύξηση των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs), που ρυθμίζονται από τον επαγωγέα μεταλλοπρωτεϊνασών EMMPRIN. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η ύπαρξη ρυθμιστικού άξονα μεταξύ της LSD1 και της EMMPRIΝ ο οποίος θα μπορούσε να προάγει την δυσλειτουργική αποδόμηση της εξωκυττάριας μήτρας κατά τη διάρκεια της χρόνιας ιικής μόλυνσης, διευκολύνοντας μάλιστα σε ασθενείς ΗΚΚ την διαφυγή καρκινικών ηπατοκυττάρων από τον κύριο όγκο και την εξέλιξη του HCV επαγόμενου ΗΚΚ προς μεταστατική νόσο.
Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η επίδραση της υπερέκφρασης, της μειορρύθμισης και της σίγησης της LSD1 στα επίπεδα έκφρασης mRNA και πρωτεΐνης της EMMPRIN αλλά και στις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις της, και ειδικότερα στην υπεργλυκοζυλίωσή της, καθώς η τελευταία αποτελεί μέτρο της λειτουργικότητας του μορίου. Κατά τα πειράματα αυτά παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση της LSD1 μείωσε το mRNA και αύξησε την ολική πρωτεΐνη και την υπεργλυκοζυλιομένη μορφή της EMMPRIN, ενώ η σίγηση της LSD1 αντέστρεψε αυτά τα φαινόμενα. Η χρήση μιας κυρίαρχα αρνητικής μετάλλαξης της LSD1, από την οποία έλειπε η καταλυτική περιοχή του ενζύμου δεν κατάφερε να ακυρώσει την αρνητική δράση της LSD1 στο mRNA της EMMPRIN, πιθανά διότι η καταλυτική περιοχή δεν εμπλέκεται στον αντίστοιχο μοριακό μηχανισμό ρύθμισης. Επιπλέον μελετήθηκε και διαπιστώθηκε η θετική επίδραση της LSD1 στην PMA-επαγόμενη πρωτεολυτική απόπτυση μιας εκκρινόμενης μορφής της EMMPRIN, βάρους 22 kDa, η οποία εντοπίστηκε για πρώτη φορά στην Huh7.5 καρκινική σειρά ΗΚΚ, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας. Παραμένει προς διερεύνηση εάν η μορφή αυτή μπορεί να δρα ως αγωνιστής ή αναστολέας της φυσιολογικής λειτουργίας της EMMPRIN. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση του ιού στην έκφραση και στη γλυκοζυλίωση της EMMPRIN κατά τη διάρκεια βραχέων και μακρών in vitro μολύνσεων των Ηuh7.5 ηπατοκυττάρων με το εργαστηριακό στέλεχος HCV-3α. Παρατηρήθηκε μια θεαματική, αυστηρά ρυθμιζόμενη, κυματοειδής αυξομείωση της EMMPRIN και της υπεργλυκοζυλίωσής της με την πάροδο του χρόνου, οι κορυφώσεις των κυμάτων της οποίας φάνηκαν να συμπίπτουν με την αρχή των επαναλαμβανόμενων ιικών κύκλων.
Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη εδραιώθηκε και αποσαφηνίστηκε ο ρυθμιστικός άξονας LSD1-EMMPRIN, μελετήθηκε η ύπαρξη της εκκρινόμενης μορφής πρωτεολυτικής απόπτυσης της EMMPRIN καθώς και η μακροπρόθεσμη επίδραση του ιού στην EMMPRIN. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν εφαλτήριο για τη λεπτομερέστερη μελέτη των μηχανισμών που συνδέουν την HCV μόλυνση με την εξέλιξη της χρόνιας ηπατικής νόσου και την επαγωγή μεταστατικής νόσου, καθώς και για τον εντοπισμό μονοπατιών-στόχων για την αποτελεσματικότερη πρόληψη και διαχείριση του μεταστατικού ΗΚΚ.
(EL)
Hepatitis C is a major health problem affecting around 1.5 million new people worldwide per year, with a total of 70 million chronic patients worldwide. The virus that causes it, Hepatitis C virus (HCV), can lead to acute or chronic infection, ranging from mild to severe liver disease, often resulting in persistent inflammation, steatosis, fibrosis, cirrhosis of the liver and even hepatocellular carcinoma (HCC). Recent advances in antiviral therapy with direct acting antivirals (DAAs) lead to eradication of the virus in almost 95% of patients. However, in cases of cirrhotic patients who have been exposed to the virus for decades, the likelihood of developing HCC or disease recurrence is substantial. The virus interacts with host proteins, leaving an epigenetic, metabolic and immunological footprint. Amongst other things, HCV regulates epigenetic factor LSD1 and affects metastatic pathways such as the increase in metalloproteinases (MMPs) that are regulated by the extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN. In the present study, we investigated the existence of a putative regulatory axis between LSD1 and EMMPRIN that could promote dysfunctional degradation of the extracellular matrix during chronic viral infection, thereby facilitating the escape of cancerous hepatocytes from the main tumor in HCC patients, as well as promoting the progression of HCV-induced HCC towards metastatic disease.
We thus investigated the overexpression, down-regulation and silencing of LSD1 on mRNA and protein expression levels of EMMPRIN and its post-translational modifications, in particular its hyperglycosylation, as the latter is a measure of the functionality of the molecule. In these experiments, it was observed that overexpression of LSD1 decreased EMMPRIN mRNA production and increased total protein, as well as the hyperglycosylated form of EMMPRIN, whereas silencing of LSD1 reversed these effects. The use of a dominant negative mutant of LSD1, which lacked the catalytic region of the enzyme, failed to abrogate the negative effect of LSD1 on EMMPRIN mRNA, presumably because the catalytic region is not involved in the corresponding molecular regulatory mechanism. In addition, the positive effect of LSD1 on PMA-induced proteolytic depletion of a secreted 22kDa form of EMMPRIN, which was identified in the Huh7.5 HCC cancer cell line for the first time, was studied. It remains to be investigated whether this form may act as an agonist or as an inhibitor of the physiological function of EMMPRIN. Lastly, we investigated, the effect of the virus on EMMPRIN expression and glycosylation during short and long-term in vitro infections of Huh7.5 hepatocytes with the laboratory strain HCV-3a. A spectacular, tightly regulated, wave- like fluctuation of EMMPRIN and its hyperglycosylation was observed over time, the peaks of the waves of which appeared to coincide with the onset of repeated viral cycles.
In conclusion, the present study established and elucidated the LSD1-EMMPRIN regulatory axis, studied the existence of the secreted proteolytic shed form of EMMPRIN and the long-term effect of HCV on EMMPRIN. These results provide a springboard for a more detailed study of the mechanisms linking HCV infection to chronic liver disease progression and metastatic disease induction, as well as for the identification of target pathways for more effective prevention and management of metastatic HCV-induced HCC.
(EN)
University of Athens
