Μοριακή και βιοχημική ανάλυση του γονιδίου β-γλυκοσιδάση της ολευρωπαΐνης στην ανάπτυξη και άμυνα της ελιάς

Molecular and biochemical analysis of the oleuropein β-glucosidase gene during the development and defense of olive

Μοριακή και βιοχημική ανάλυση του γονιδίου β-γλυκοσιδάση της ολευρωπαΐνης στην ανάπτυξη και άμυνα της ελιάς

Koudounas, Konstantinos

Κουδουνάς, Κωνσταντίνος

PhD Thesis

2016

Η ολευρωπαΐνη, το επικρατέστερο σεκοϊριδοειδές στην ελιά (Olea europaea), εμπλέκεται σε ένα δυαδικό σύστημα άμυνας που αποτελείται από μια β-γλυκοσιδάση η οποία απογλυκοζυλιώνει την ολευρωπαΐνη παράγοντας ένα τοξικό άγλυκο μόριο με δομή παρόμοια με την γλουταραλδεΰδη. Παρότι ο μηχανισμός άμυνας έχει μελετηθεί αρκετά, δεν έχει χαρακτηριστεί ακόμα κάποια β-γλυκοσιδάση εξειδικευμένη για την ολευρωπαΐνη. Στην παρούσα μελέτη περιγράφεται ο μοριακός χαρακτηρισμός του cDNA του OeGLU που κωδικοποιεί για μια αμυντική β-γλυκοσιδάση εξειδικευμένη για τα τερπενοειδή. Ετερόλογη έκφραση του OeGLU σε E. coli δεν οδήγησε σε ενεργό ένζυμο αλλά μέσω in planta παροδικής έκφρασης αποδείχθηκε ότι το OeGLU μπορεί να απογλυκοζυλιώσει και να ενεργοποιήσει την ολευρωπαΐνη σε έναν μεταβολίτη με ισχυρή δυνατότητα μαζικής συμπλοκοποίησης και διασύνδεσης πρωτεϊνών. Η in silico πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής του ενζύμου και ανάλυση μοριακής προσκόλλησης της ολευρωπαΐνης σε αυτήν έδειξε ότι το OeGLU έχει την χαρακτηριστική (β/α)8 TIM barrel δομή και το ενεργό κέντρο αποτελείται από συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα που σχετίζονται με την κατάλυση της αντίδρασης ενώ τα αμινοξέα που είναι υπεύθυνα για την αναγνώριση του άγλυκου τμήματος είναι μη συντηρημένα. Οι κινητικές παράμετροι του απομονωμένου ενζύμου που υπολογίστηκαν είναι σε συμφωνία με τιμές που έχουν αναφερθεί για απομονωμένες β-γλυκοσιδάσες από τη ελιά που εξειδικευμένα απογλυκοζυλιώνουν την ολευρωπαΐνη. Το ένζυμο OeGLU βρέθηκε να τοποθετείται υποκυτταρικά στον πυρήνα των κυττάρων λόγω σινιάλου πυρηνικής τοποθέτησης (NLS) που βρίσκεται στο C-άκρο και διαγραφή του οποίου οδηγεί σε κυτταροπλασματική τοποθέτηση. Η τεταρτοταγής δομή του ενζύμου βρέθηκε να είναι μεγαλομοριακή και το OeGLU ομοπολυμερίζεται. Η εξάλειψη του NLS οδήγησε επίσης σε δομική μετάλλαξη αφού το ένζυμο ανιχνεύτηκε αποκλειστικά σαν μονομερές με μη μετρήσιμη ενζυμική δραστικότητα. Το C-άκρο του OeGLU πιθανότατα εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση των μονομερών για την δημιουργία του ομοπολυμερούς, μια βασική προϋπόθεση για την ενεργότητα του ενζύμου. Επίσης αναφέρεται για πρώτη φορά ότι η ενζυμική απογλυκοζυλίωση του OeGLU παράγει φθορισμό, όπως φάνηκε από τα ζυμογράμματα, και με αυτή την μέθοδο είναι εφικτή η εξειδικευμένη ανίχνευση ισοενζύμων του OeGLU.

Oleuropein, the major secoiridoid compound in olive (Olea europaea), is involved in a sophisticated two-component defense system comprising a β-glucosidase enzyme that activates oleuropein into a toxic glutaraldehyde-like structure. Although oleuropein deglycosylation studies have been monitored extensively, an oleuropein β-glucosidase gene has not been characterized as yet. In the present study is reported the molecular characterization of OeGLU cDNA from olive encoding a β-glucosidase belonging to the defence-related group of terpenoid-specific glucosidases. Heterologous expression of OeGLU in E. coli failed to produce an active enzyme but in planta recombinant protein expression assays showed that OeGLU deglycosylated and activated oleuropein into a strong protein cross-linker. Homology and docking modelling predicted that OeGLU has a characteristic (β/α)8 TIM barrel conformation and a typical construction of a pocket-shaped substrate recognition domain composed of conserved amino acids supporting the β-glucosidase activity and non-conserved residues associated with aglycon specificity. Kinetic parameters of the purified enzyme came in agreement with reported values of purified oleuropein-specific β-glucosidases from olive. Subcellular localization studies of OeGLU proved that the enzyme is localized in the nucleus due to a Nuclear Localization Signal (NLS) located in the C-termini of the enzyme and deletion of the NLS resulted in cytoplasmic localization. The quaternary structure of OeGLU in vivo is a high molecular weight homomultimer and interestingly deletion of the NLS resulted also in a structural mutation, as the enzyme could be detected in solely monomeric form with null enzymatic activity. The C-termini of OeGLU is most likely involved in protein-protein interaction of the monomers for the assembly of the homomultimer, a key factor for the enzymatically active enzyme. Additionally it is reported for the first time that the enzymatic deglycosylation of oleuropein is a fluorogenic reaction as proved by in-gel activity assays (zymograms) and this methodology will help for highly specific screening for isoenzymes of OeGLU.

Φυσικές Επιστήμες ➨ Βιολογία

Γεωπονικές Επιστήμες και Κτηνιατρική ➨ Γεωπονική Βιοτεχνολογία

Agricultural and Veterinary Sciences

Γεωπονική Βιοτεχνολογία

Biological Sciences

Γεωπονικές Επιστήμες και Κτηνιατρική

Agricultural Biotechnology

Βιολογία

Β-ΓΛΥΚΟΣΙΔΑΣΗ

Φυσικές Επιστήμες

Άμυνα φυτών

β-Glucosidase

plant defense

Oleuropein

Ετερόλογη έκφραση

Natural Sciences

Ολευρωπαΐνη

Heterologous expression

Ελληνική γλώσσα

Agricultural University of Athens

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Τμήμα Βιοτεχνολογίας. Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας

Εθνικό Κέντρο Τεκμηρίωσης και Ηλεκτρονικού Περιεχομένου (ΕΚΤ)

Εθνικό Αρχείο Διδακτορικών Διατριβών

Συλλογή ΕΑΔΔ