The discovery of neural precursor cells (NPCs) and the concomitant intensive research in the field offer regenerative medicine novel approaches, enabling it to tackle conditions, such as neurodegenerative diseases. Transplantation of NPCs is nowadays considered a cutting-edge treatment for these conditions and many related clinical trials have been already completed or are still ongoing. However, little is known about the antigenicity of NPCs, with most studies addressing the question whether their antigenicity could lead to rejection of the transplanted cells. In this study we investigated the antigenic potential of syngeneic NPCs emulsion, upon subcutaneous (s.c.) administration to wild type C57BL/6 mice, following a standard immunization protocol. The whole IgG repertoire expressed upon immunization, was cloned into a Fab phage display vector. From the created phage display library, Fab expressing clones interacting with NPCs lysate proteins were selected with the biopanning technique. The IgG Fab fragment from clone 65 showed to be reactive in diverse immunological experiments against antigens originating from NPCs lysates and/or whole brain lysate.Using a standard immunization protocol to administer NPCs antigens, and applying the Fab fragment phage display technique, we were able to isolate at least a monoclonal IgG Fab fragment, which interact with different mouse brain proteins. The possibility of production of such antibodies in the host organisms, following NPCs transplantation has to be further investigated.
Η ανακάλυψη των στελεχιαίων προγονικών κυττάρων ακολουθήθηκε από μια έντονη ερευνητική δραστηριότητα στο πεδίο της αναγεννητικής ιατρικής, με σκοπό την αντιμετώπιση ποικίλων νόσων του ΚΝΣ. Πράγματι, μια σειρά κλινικών μελετών που αφορούν την μεταμόσχευση πολυδύναμων προγονικών νευρικών κυττάρων έχει ήδη ολοκληρωθεί ή είναι υπό εξέλιξη. Σημαντική βοήθεια στις παραπάνω μελέτες προέρχεται από προόδους που επιτευχθήκαν στο πεδίο της βιοϊατρικής έρευνας, πιο συγκεκριμένα αυτές που αφορούν την απομόνωση-καλλιέργεια πολυδύναμων νευρικών κυττάρων. Η καλλιέργεια πολυδύναμων κυττάρων με την μορφή νευροσφαιριδίων έχει αποδειχτεί ιδιαίτερα αποτελεσματική και για τον λόγο αυτό χρησιμοποιείται ευρέως για in vitro και in vivo μελέτες. Τα αναμενόμενα θεραπευτικά αποτελέσματα από τέτοιου είδους μεταμοσχεύσεις έγκεινται στο γεγονός ότι πολυδύναμα νευρικά κύτταρα έχουν την ιδιότητα να μεταναστεύουν στα σημεία των βλαβών. Εκεί, βοηθούν την επούλωση των βλαβών με διττό τρόπο. Διαφοροποιούμενα σε νευρικά κύτταρα αναπληρώνουν κατεστραμμένους νευρώνες ενώ διαφοροποιούμενα σε νευρογλοιακά κύτταρα εκλύουν αναπτυξιακούς και άλλους τροφικούς παράγοντες αναστρέφοντας έτσι τις βλάβες. Βασικό μέλημα σε μία μεταμόσχευση είναι ο έλεγχος συμβατότητας του μοσχεύματος. Αυτόλογα ή συγγενή μοσχεύματα θεωρούνται ασφαλή, καθώς δεν ενεργοποιούν το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Στο σημείο αυτό περιορίζεται, σύμφωνα με όσα γνωρίζουμε, η έρευνα σχετικά με την δυναμική της αντιγονικότητας προγονικών νευρικών κυττάρων. Επιπλέον, είναι γνωστό, πως ένα σημαντικό πρόβλημα σε τέτοιου είδους μεταμοσχεύσεις είναι το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων. Δεν γνωρίζουμε όμως την τύχη των κυττάρων που δεν επιβιώνουν και κυρίως αν κυτταρικά τους θραύσματα είναι δυνατό να λειτουργήσουν αντιγονικά ενεργοποιώντας την χυμική απόκριση του ανοσοποιητικού. Εξάλλου το ΚΝΣ δεν θεωρείται πλέον «immune privileged site», ως ένα όργανο δηλαδή που δεν έχει πρόσβαση το ανοσοποιητικό σύστημα. Αντίθετα γνωρίζουμε ότι το ανοσοποιητικό συνεισφέρει στην ομοιόσταση του νευρικού ιστού. Ακόμα μεγαλύτερη όμως είναι η εμπλοκή του σε παθολογικές καταστάσεις, ιδίως αυτές που επηρεάζουν την λειτουργία του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Συνεπώς, η δράση του ανοσοποιητικού συστήματος στο ΚΝΣ δεν είναι πάντοτε επιβλαβής αλλά μπορεί να είναι και επικερδής. Στην παρούσα διατριβή προσπαθήσαμε να απαντήσουμε στο ερώτημα της δυνητικής αντιγονικής δράσης των συγγενών κυττάρων NPCs σε μυς C57BL/6. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε το φαγομίδιο Fab θραυσμάτων IgG phage display pComb3XSS για την δημιουργία μιας άνοσης (immune) βιβλιοθήκης. Φυσιολογικοί μυς C57BL/6 ανοσοποιήθηκαν με ένα εναιώρημα νευροσφαιριδίων ακολουθώντας ένα κοινό πρωτόκολλο ανοσοποίησης και τα θραύσματα Fab που εκφράζονταν στους σπλήνες των ανοσοποιημένων ζώων κλωνοποιήθηκαν στον προαναφερόμενο φορέα. Η βιβλιοθήκη εμπλουτίστηκε με την διαδικασία biopanning, ερχόμενη σε επαφή με ακινητοποιημένο το πρωτέομα των νευροσφαιριδίων. Κλώνοι θραυσμάτων Fab απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν ως προς την πρωτοταγή δομή τους. Περαιτέρω, εκφράστηκαν ως γενετικά ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα σε κύτταρα E. coli. Ένας από τους κλώνους, ο κλώνος 65, έδειξε σε πειράματα ανοσοϊστοχημείας ότι συνδέεται ισχυρά με αντιγόνα στελεχιαίων νευρικών. Οι πρωτεΐνη/ες που αναγνωρίζει ο κλώνος αυτός ταυτοποιήθηκαν μέσω ανοσοκατακρήμνισης ακολοθούμενη από ανάλυση φασματομετρίας μάζας.
National Documentation Centre (EKT)
