Τα μακροφάγα αποτελούν έναν εξαιρετικά ετερογενή πληθυσμό, τα οποία επιτελούν
ποικίλους ρόλους στην ανοσολογική απόκριση όπως η αντιμετώπιση των παθογόνων, η
επίλυση της φλεγμονής και η διατήρηση της ομοιόστασης του ιστού. Παρουσία
διαφορετικών σημάτων αποκτούν διαφορετικούς φαινοτύπους που χαρακτηρίζονται από
διακριτή μεταγραφική, επιγενετική και μεταβολική ρύθμιση. Ο μεταβολισμός έχει κεντρικό
ρόλο στην ενεργοποίηση των μακροφάγων. Διαφορετικά σήματα προκαλούν αλλαγές στον
μεταβολισμό, οι οποίες επηρεάζουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων και υποστηρίζουν
την λειτουργική τους ετερογένεια. Η PHF8 ανήκει στην οικογένεια των απομεθυλασών
λυσίνης που περιέχουν τομέα jumonji C. Αρχικά δεδομένα του εργαστηρίου είχαν δείξει
διαφορές στην έκφραση προφλεγμονωδών γονιδίων σε κυτταρικές σειρές Raw264.7 που
υπερεκφράζουν την PHF8 και κυτταρικές σειρές Raw264.7 όπου η PHF8 έχει σιγηθεί. Οι
κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν την PHF8 εμφανίζουν χαμηλότερη έκφραση
προφλεγμονωδών μαρτύρων , ενώ το αντίθετο παρατηρείται στις knock out κυτταρικές
σειρές μετά από επαγωγή με LPS. Προκειμένου να διερευνήσουμε περαιτέρω τον
μηχανισμό με τον οποίο η PHF8 ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση πραγματοποιήσαμε
πείραμα αλληλούχισης RNA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν διαφορές σε μεταβολικά
γονίδια όπως γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση λιπιδίων και πρωτεϊνών, η ρύθμιση
των οποίων από την PHF8 πιθανόν να αποτελεί ένα μηχανισμό μέσω του οποίου η PHF8
ρυθμίζει την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Παράλληλα εντοπίσαμε διαφορές στην
ενεργοποίηση του mTORC1, σύμπλοκο στο οποίο επιδρούν ποικίλα ερεθίσματα και
ρυθμίζει μεταβολικά μονοπάτια. Κύτταρα που υπερέκφραζαν την PHF8 παρουσίαζαν
αυξημένη ενεργοποίηση του συμπλόκου mTORC1 στα βασικά επίπεδα, ενώ αυτό δεν
εμφάνιζε περαιτέρω ενεργοποίηση μετά από επαγωγή με LPS σε αντίθεση με τα κύτταρα
αναφοράς. Το mTORC1 ενεργοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα Hif1a, ο οποίος με τη
σειρά του ρυθμίζει την έκφραση γλυκολυτικών γονιδίων, χαρακτηριστικό των M1
μακροφάγων. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα σχετικά με την ενεργοποίηση του mTORC1
γλυκολυτικά γονίδια όπως η εξοκινάση 3 (hk3) και η φωσφοφρουκτοκινάση (pfkp)
εμφανίζουν αυξημένη έκφραση στα βασικά επίπεδα αλλά δεν εμφανίζουν επιπλέον αύξηση
μετά από χειρισμό με LPS στα κύτταρα που υπερεκφράζουν την PHF8, φαινόμενο που θα
μπορούσε να εξηγεί την μειωμένη έκφραση κυτταροκινών στα κύτταρα που
υπερεκφράζουν την PHF8. Επιπροσθέτως τα αποτελέσματα της αλληλούχισης RNA έδειξαν
αυξημένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το stress ενδοπλασματικού δικτύου,
αποτέλεσμα το οποίο επιβεβαιώσαμε και με ανάλυση κατά Western. Ο ανασταλτικός ρόλος
της PHF8 στην κλασσική ενεργοποίηση των μακροφάγων όπως και αυξημένη παραγωγή
TNF μετά από πρωτόκολλο ανοχής στην ενδοτοξίνη παρατηρήθηκε επίσης και σε BMDMs
ποντικών μετά από σίγηση της PHF8. Τέλος δείξαμε ότι η PHF8 επάγεται μετά από χειρισμό
με α-κετογλουταρικό, έναν μεταβολίτη που έχει δειχθεί ότι επάγει ανοχή. Συνεπώς η PHF8
θα μπορούσε να είναι ένας επιγενετικός ρυθμιστής που διαμεσολαβεί αυτόν τον
φαινότυπο. Συμπερασματικά στην παρούσα εργασία δείξαμε ότι η απομεθυλάση ιστονών
PHF8 είναι βασικός ρυθμιστής της ενεργοποίησης των μακροφάγων όπως και του
μεταβολισμού, ενώ πιθανόν συντελεί στην ανάπτυξη της ανοχής στην ενδοτοξίνη.
(EL)
Macrophages as a population display great heterogeneity and serve various functions in
immune response including elimination of pathogens, resolution of inflammation and tissue
homeostasis. In response to different stimuli they exhibit great plasticity reflected at the
transcriptional, epigenetic and metabolic level. Metabolism has a central role during
macrophage activation. Different polarizing signals cause distinct metabolic changes, which
govern macrophage activation and support the great macrophage plasticity. PHF8 is a
Jumonji C domain containing histone lysine demethylase. Preliminary data have shown
differences in inflammatory response in Raw264.7 cells overexpressing (O/E) PHF8 and
Raw264.7 cells knock out (K.O.) for PHF8 with cells overexpressing PHF8 having lower levels
of proinflammatory markers production and K.O. cells having enhanced proinflammatory
phenotype after LPS stimulation. We performed RNA sequencing in these cells to gain
further insight into the mechanism of PHF8 regulation of immune response. The results
revealed differences in metabolic genes such as genes involved in lipid and protein
biosynthesis, whose regulation of expression by PHF8 may underlie its inhibitory role in
classic macrophage activation. In support to this notion mTORC1, a central complex which
incorporates various signals and regulates metabolic pathways was positively regulated by
PHF8 at the naïve state, but had impaired activation after LPS treatment in cells
overexpressing PHF8. mTORC1 activates Hif1a, which in turn control glycolytic gene
expression, a hallmark of M1 macrophages. Consistent with mTORC1 activation, major
glycolytic genes such as hk3 and pfkp have increased expression at the naïve state but no
further induction in PHF8 overexpressing cells, which could explain the reduced
responsiveness of PHF8 O/E cells. Additionally in the RNA sequencing results we observed
increased expression of E.R. stress induced genes, which we also validated by western blot.
The negative role of PHF8 in classic macrophage activation was also observed in mouse
BMDMs combined with enhanced TNF production at the endotoxin tolerant state in PHF8
knock down BMDMs. mTORC1 activation was also increased at the endotoxin tolerant state
in PHF8 knock down BMDMs. Last but not least we showed that PHF8 expression is induced
post α-KG treatment, a metabolite known to induce tolerance, indicating that PHF8 is a
possible mediator of this phenotype. In conclusion, we showed in the present study that the
histone demethylase PHF8 is a negative regulator of macrophage activation and an
important regulator of macrophage metabolism revealing its potential role in shaping
macrophage phenotype in the context of endotoxin tolerance.
(EN)