Τα τελευταία χρόνια ένας αυξανόμενος αριθμός επιστημονικών ερευνών έχει καταδείξει την εμπλοκή και την επίδραση των επιγενετικών παραγόντων στην έναρξη και την προαγωγή του καρκίνου. Η KMT2C/MLL3 μεθυλοτρανσφεράση είναι ένας τέτοιος επιγενετικός παράγοντας, που καταλύει τη μονομεθυλίωση της λυσίνης 4 στην ουρά της ιστόνης Η3 (Η3Κ4), μία επιγενετική τροποποίηση που σχετίζεται με τη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων. Η KMT2C εικάζεται πως έχει ογκοκατασταλτικό ρόλο και όπως πολλοί άλλοι επιγενετικοί παράγοντες, εμφανίζεται μεταλλαγμένη σε μία ποικιλία καρκινικών τύπων. Στην περίπτωση αυτή, επηρεάζεται συνολικά η επιγενετική κατάσταση του γενετικού υλικού και η έκφραση διαφόρων γονιδίων, μεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται και εκείνα που σχετίζονται με το μηχανισμό του ομόλογου ανασυνδυασμού για την επιδιόρθωση των δίκλωνων θραύσεων (Double Strand Breaks-DSBs) στο γονιδίωμα. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα που έχουν απενεργοποιημένη την KMT2C (KMT2C-/KD1) έχουν ελαττωματικό το συγκεκριμένο μηχανισμό και στρέφονται σε μηχανισμούς επιδιόρθωσης που είναι περισσότερο επιρρεπείς σε λάθη, όπως η μη ομόλογη σύνδεση άκρων, και πιθανά συμβάλλουν στην αύξηση της γενωμικής αστάθειας. Ωστόσο, έχει παρατηρηθεί από προηγούμενες έρευνες του εργαστηρίου μας ότι η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου μένει ανεπηρέαστη από την απενεργοποίηση της KMT2C. Επομένως, η μελέτη των επιπέδων των DSBs στα κύτταρα αυτά καθ’όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον.
Η διάκριση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου μπορεί να γίνει με τη βοήθεια του συστήματος FastFUCCI, το οποίο βασίζεται στη σήμανση των πρωτεϊνών Geminin και Cdt1, με δύο διαφορετικές φθορίζουσες πρωτεΐνες (Fluorescent Proteins-FPs) και στην περιοδική πρωτεόλυσή τους σε συγκεκριμένα στάδια του κυτταρικού κύκλου, με αποτέλεσμα τα κύτταρα μελέτης να εκπέμπουν φθορισμό διαφορετικού μήκους κύματος ανάλογα με τη φάση στην οποία βρίσκονται. Παράλληλα, η οπτικοποίηση των DSBs μπορεί να γίνει μέσω ανοσοφθορισμού με τη χρήση αντισωμάτων έναντι της ιστόνης γΗ2ΑΧ που συσσωρεύεται στα σημεία των δίκλωνων θραύσεων.
Οι δύο αυτοί άξονες αποτέλεσαν και τον πυρήνα της παρούσας διπλωματικής, στην οποία επιχειρήθηκε ανάλυση της προόδου του κυτταρικού κύκλου σε KMT2C- καρκινικά κύτταρα ουροδόχου κύστης (ΗΤΒ9 και Τ24) καθώς και η καταμέτρηση των δίκλωνων θραύσεων στο γονιδίωμά τους στη G1 και τη G2 φάση του κυτταρικού κύκλου, σε σύγκριση με πειραματικά κύτταρα ελέγχου με ενεργή την αντίστοιχη μεθυλοτρανσφεράση.
Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν για μία ακόμα φορά την απουσία διαφοράς στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μεταξύ των σειρών μελέτης, ενώ παράλληλα κατέδειξαν ότι τα KMT2C- κύτταρα κινούνται εν γένει με μεγαλύτερο ποσοστό βλάβης τόσο στη G1 όσο και στη G2. Με δεδομένο ότι το G1 σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου είναι συνήθως ελαττωματικό στους περισσότερους τύπους καρκίνου και τα περισσότερα κύτταρα βασίζονται στο G2 σημείο ελέγχου για την είσοδό τους στη μίτωση, τα ευρήματα αυτά πιθανά υποδηλώνουν μία προσαρμογή των KMT2C- σε υψηλά επίπεδα βλάβης και μία προσαρμογή του G2 checkpoint σε χαμηλότερα επίπεδα ισχύος σε αυτά.
(EL)
In the past few years, an increasing number of studies have focused on the impact of epigenetic factors in cancer initiation and progression. KMT2C/MLL3 lysine methyltransferase catalyzes the monomethylation of lysine 4 on histone H3 tail (H3K4), an epigenetic modification directly related to transcriptional gene activation. KMT2C has a putative tumor suppressor role and is frequently downregulated or mutated in a variety of cancers leading to an altered epigenetic landscape and gene expression profile. Notably, KMT2C inactivation is associated with down-regulation of homologous recombination (HR) genes that are actively involved in DSB repair. As a consequence, cells with silenced KMT2C (KMT2C-/KD1) appear to be HR-deficient and highly dependent on more error-prone repair mechanisms, such as Non-Homologous End Joining, which possibly contribute to higher levels of genomic instability in those cells. Previous experiments in our lab have shown that cell cycle progression remains unaffected by the silencing of KMT2C, despite the potential high levels of DNA damage. As a result, the study of DSB levels throughout the cell cycle in KMT2C deficient background is a topic of great interest.
The visualization and distinction of cell cycle phases can be achieved through the FastFUCCI system (Fast Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), which is based upon the labeling of Geminin and Cdt1 proteins with distinct fluorescent ones (Fluorescent Proteins-FPs), and their periodic proteasomal degradation during specific cell cycle stages. In parallel, the visualization of DSBs foci in the cell nucleus can be achieved via immunofluorescence experiments that utilize antibodies against γΗ2ΑΧ histone, which accumulates in DSBs. This integrated analysis was applied in control and KMT2C- bladder cancer cell lines ΗΤΒ9 and T24 in order to compare their DSBs levels between the G1 and G2 cell cycle phases.
Our results confirmed a common pattern in cell cycle progression between the experimental and control cell lines despite the increased levels of DNA damage that were observed in the KMT2C- cells in both the G1 and G2 phases of the cell cycle. Considering the fact that the G1 checkpoint mechanism is usually defective in the majority of cancers and most of the cells are dependent upon the G2 checkpoint for their entry to mitosis, our findings possibly suggest an adaptation of the KMT2C- cells to high levels of genomic damage and a potential G2 checkpoint abrogation.
(EN)