Σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς πραγματοποιείται η διαδικασία την συρραφής, στα πρόδρομα μετάγραφα των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, με στόχο τον σχηματισμό ώριμων mRNAs, μέσα από την αποβολή εσωνίων και συρραφή εξωνίων. Το φαινόμενο εναλλακτικής συρραφής δίνει την δυνατότητα δημιουργίας ποικιλίας mRNA μεταγράφων τα οποία προέρχονται από ένα μόνο γονίδιο. Η πολυπλοκότητα της συγκεκριμένης διαδικασίας, δικαιολογεί την αυστηρή ρύθμιση στην οποία υπόκειται. Ωστόσο, παρατηρούνται αρκετά φαινόμενα ρυθμιστικής δυσλειτουργίας, τα οποία μπορεί να σχετίζονται άμεσα με δυσπλασίες. Έτσι, πολλά εναλλακτικά μετάγραφα τα οποία παράγονται από μη αναμενόμενα γεγονότα συρραφής, μπορεί να αντιπροσωπεύουν πιθανούς καρκινικούς βιοδείκτες ή θεραπευτικούς στόχους.
Η οικογένεια ανθρώπινων γονιδίων των καλλικρεϊνών (KLKs) , αποτελείται από 15 μέλη και κωδικοποιεί τη μεγαλύτερη ομάδα πρωτεασών σερίνης. Τα KLKs έχουν μεγάλη ομοιότητα και αποτελούνται από πέντε κωδικά εξώνια παρόμοιου μεγέθους καθώς και συντηρημένες αλληλουχίες εσωνίων. Επιπλέον, ως οικογένεια γονιδίων, παρουσιάζει αρκετά φαινόμενα εναλλακτικής συρραφής, με κύρια την παράλειψη εξωνίων, τη διατήρηση εσωνίων, την εναλλακτική 5΄ και 3΄ θέση συρραφής καθώς και τη χρήση εναλλακτικών θέσεων πολυαδενυλίωσης. Αρκετά από τα εναλλακτικά μετάγραφα, μπορεί να εμφανίζουν μη φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης σε διάφορες κακοήθειες, έχοντας προγνωστική ή/και διαγνωστική αξία. Είναι πλέον γνωστό, οτι τα mRNAs των καλλικρεϊνών, στοχεύονται από συγκεκριμένα miRNAs μόρια, στις 3΄-UTR περιοχές τους, ρυθμίζοντας την έκφρασή τους.
Η μελέτη της εναλλακτικής συρραφής έχει επεκταθεί αρκετά, κυρίως με τη χρήση της τεχνολογίας της αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS). Συγκεκριμένα, η αλληλούχηση RNA (RNA seq) δίνει τη δυνατότητα ανάλυσης του mRNA εναλλακτικού ματίσματος και την ανίχνευση νέων εναλλακτικών μεταγράφων, με υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια. Συνδυαστικά με την τεχνική ταχείας ενίσχυσης των 3’-άκρων cDNA (3΄-RACE), μπορεί να προσφέρει την δυνατότητα μελέτης των εναλλακτικών θέσεων πολυαδενυλίωσης και την ανίχνευση εναλλακτικών 3΄-αμετάφραστων περιοχών (3´-UTRs) στα KLKs.
Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανίχνευση και ταυτοποίηση νέων εναλλακτικών 3´-αμετάφραστων περιοχών (3´-UTRs) στα ανθρώπινα γονίδια της οικογένειας των καλλικρεϊνών, με τη χρήση και ανάλυση δεδομένων αλληλούχησης νέας
γενιάς (NGS). Για την επίτευξη του στόχου αυτού, έγινε βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων από NGS για την επιλογή των KLK γονιδίων και των θέσεών τους, τα οποία διαθέτουν πιθανάν νέα εναλλακτικά 3΄-UTRs. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε nested 3' RACE με τη χρήση ειδικών ζευγών εκκινητών, επιτρέποντας την ενίσχυση των ανθρώπινων μεταγράφων των γονιδίων KLKs, σε συνολικά 32 κυτταρικές σειρές από ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς. Ακολούθως, η ταυτοποίηση των νέων εναλλακτικών 3΄-UTRs τα οποία ανακαλύφθηκαν, έγινε μέσω αλληλούχησης κατα Sanger.
Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 2 νέα εναλλακτικά 3’-UTRs σε μετάγραφα του γονιδίου KLK7 και ένα τμήμα νέου εναλλακτικού 3’-UTR σε μετάγραφα του γονιδίου KLK14. Επιπλέον, έγινε εντοπισμός της θέσης και του μήκους αλληλουχίας, 7 επιπλέον πιθανών εναλλακτικών 3’-UTRs, σε μετάγραφα των KLKs, όπως υποστηρίζουν τα αποτελέσματα από τις ηλεκτροφορήσεις των προϊόντων των αντιδράσεων 3΄-RACE, για τα οποία απαιτείται περαιτέρω μελέτη για την ταυτοποίησή τους. Από την μελέτη των μεταγράφων των γονιδίων των καλλικρεϊνών, παρατηρήθηκε μεγάλη διαφορά στα μήκη και την αλληλουχία των 3΄-UTRs που περιλαμβάνουν. Κατ΄ επέκταση, παρατηρούνται και διαφορετικά μόρια miRNA τα οποία δυνητικά μπορούν να στοχεύσουν τα εναλλακτικά 3΄-UTRs, όπως αποκαλύπτουν διάφοροι αλγόριθμοι εύρεσης miRNA μορίων στόχευσης γονιδίων.
Τα νέα εναλλακτικά 3΄-UTRs τα οποία ταυτοποιήθηκαν είναι μόνο λίγα από τα πληθώρα εναλλακτικών 3΄-UTRs που πιθανά διαθέτουν τα διάφορα μετάγραφα των συγκεκριμένων γονιδίων. Η στόχευση των περιοχών αυτών από miRNA μόρια και η κατα συνέπεια ρύθμιση που υπόκεινται τα γονίδια αυτά, όσον αφορά τα επίπεδα έκφρασής τους, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις κακοηθειών, οδηγεί στην αναγκαιότητα περαιτέρω μελέτης των 3΄-εναλλακτικών μεταγράφων των γονιδίων των καλλικρεϊνών, καθώς μπορούν να αποτελέσουν σημαντικούς διαγνωστικούς ή/και προγνωστικούς καρκινικούς βιοδείκτες.
(EL)
In all eukaryotic organisms, the process of splicing is carried out in the precursor translations of protein-coding genes, with the aim of generating mRNAs through the cleavage of insertions and the exon splicing. The alternative splicing phenomenon enables the generation of a variety of mRNA transcripts derived from a single gene. The complexity of the procedure justifies the strict regulation to which it is subject. However, there are several regulatory dysfunctions that may be directly related to malformations. Thus, many alternative translations produced by unexpected splice events may represent potential cancer biomarkers or therapeutic targets.
The human kallikrein gene family (KLKs) consists of 15 members and encodes the largest group of serine proteases. The KLKs are highly uniform and consist of five codons of similar size and conserved sequences. In addition, as a gene family, several alternative synergy phenomena occur, with major exons skipping, alternative 5’ and 3’ splicing sites as well as the use of alternative polyadenylation sites. Alternative translations may have abnormal expression values in various malignancies, with predictive and / or diagnostic value. It is now known that kallikrein mRNAs are targets of specific miRNAs in their 3’-UTR domains, regulating their expression.
The study of alternative stapling has been greatly expanded, notably with the use of next generation sequencing technology (NGS). In particular, the RNA sequence (RNA seq) enables the analysis of the alternative mRNA complex and the detection of new alternative transcripts, with high sensitivity and accuracy. Combined with the 3'-terminal cDNA rapid amplification technique (3’-RACE), it may offer the opportunity to study alternative polyadenylation sites and detect alternative 3-untranslated regions (3'-UTRs) in KLKs.
The aim of this thesis was to identify and identify new alternative 3'-translational regions (3'-UTRs) in the human genes of the kallikrein family, using next generation sequencing (NGS) data. To achieve this goal, bioinformatic analysis of NGS data on the selection of KLK genes and their locations, which may potentially have new alternative 3’-UTRs, was performed. Next, a nested 3’-RACE was performed using specific pairs of primers, allowing the amplification of human transcripts of KLKs in a total of 32 human cancer tissue lines. Subsequently, the identification of the new alternative 3’-UTRs discovered was carried out by Sanger sequencing.
In total, 2 new alternative 3'-UTRs were identified in translations of the KLK7 gene and one portion of a new alternative 3'-UTR in transcripts of the KLK14 gene. In addition, 7 potential
alternative 3'-UTRs, in translations of KLKs, support the results from the 3’-RACE product of electrophoresis, for which further study is needed to identify them. From the study of transcripts of the kallikrein genes, there was a large difference in the lengths and sequences of the 3’-UTRs they contain. By extension, different miRNA molecules are also observed which can potentially target alternative 3’-UTRs, as revealed by various algorithms for finding miRNA gene targeting molecules.
The new 3’-UTR variants identified are only a few of the numerous 3’-UTR alternatives that may possess the different transcripts of those genes. The detection of these regions by miRNA molecules and consequently the regulation of these genes with respect to their expression levels, especially in cases of malignancies, necessitates further study of the 3 alternative transcripts of the kallikerlin genes, as important diagnostic and / or and prognostic cancer biomarkers.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
