Τα μέλη της οικογένειας γονιδίων BCL2 κατέχουν εξέχοντα ρόλο στην απόπτωση, μια ενεργή διαδικασία σκόπιμης κυτταρικής αυτοκαταστροφής ή αλλιώς προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Σύμφωνα με δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, οι πρωτεϊνες της οικογένειας BCL2, μοιράζονται από μία έως τέσσερις ομόλογες επικράτειες BH (BH domains), τις BH1, BH2, BH3 και BH4. Οι επικράτειες αυτές διαμεσολαβούν την ετεροδιμερική και ομοδιμερική αλληλεπίδραση μεταξύ των μελών της οικογένειας BCL2, παίζοντας έτσι κρίσιμο ρόλο στη φυσιολογική λειτουργία τους. Οι πρωτεϊνες της οικογένειας BCL2 κατατάσσονται ανάλογα με την αποπτωτική τους δράση, σε τρεις υποοικογένειες, τις αντι-αποπτωτικές, τις προ-αποπτωτικές πρωτεϊνες και τις πρωτεϊνες BH3-only, που έχουν επίσης προ-αποπτωτική δράση. Όσον αφορά τη δομή τους, οι αντι-αποπτωτικές πρωτεϊνες περιλαμβάνουν και τις τέσσερις BH επικράτειες μαζί με μια διαμεμβρανική περιοχή TM, οι αντι-αποπτωτικές χαρακτηρίζονται από απουσία της BH4 επικράτειας, ενώ οι BH3-only πρωτεϊνες φέρουν μόνο την επικράτεια BH3.
Η εναλλακτική συρραφή (AS, alternative splicing) (ή αλλιώς μάτισμα) είναι μια μετα-μεταγραφική διαδικασία κατά την οποία από ένα πρόδρομο μόριο mRNA, προκύπτουν νέα εναλλακτικά μετάγραφα mRNA. Τα μετάγραφα αυτά, συχνά κωδικοποιούν δομικά και ίσως λειτουργικά διαφορετικές πρωτεϊνικές ισομορφές, ενώ σχετίζονται με διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες. Ένα από τα πιο γνωστά παραδείγματα είναι αυτό του γονιδίου BCL2L1 (ή BCL-X), ενός μέλους της οικογένειας γονιδίων BCL2. Από το γονίδιο αυτό, μέσω εναλλακτικής συρραφής, προκύπτουν μετάγραφα που κωδικοποιούν δύο διακριτές πρωτεϊνικές ισομορφές με διακριτές, και μάλιστα αντίθετες λειτουργίες. Η μεγαλύτερη πρωτεϊνική ισομορφή BCLXL έχει βρεθεί ότι έχει προ-αποπτωτική δράση, ενώ η μικρότερη BCLXS, αντι-αποπτωτική δράση. Η διερεύνηση των μεταγράφων του γονιδίου αυτού αποτέλεσε στόχο για την παρούσα διπλωματική εργασία.
Βασιζόμενοι σε μια εκτενή βιοπληροφορική ανάλυση για τη συλλογή όλης της καταχωρημένης γνώσης σχετικά με το γονίδιο BCL2L1, εκτελέσαμε μια σειρά πειραμάτων που περιλάμβανε, κυρίως, τις τεχνικές της αντίστροφης μεταγραφής, της απλής PCR, αλλά και της επάλληλης PCR. Έτσι, καταλήξαμε στην πιθανότητα ύπαρξης 24 νέων εναλλακτικών μεταγράφων του γονιδίου BCL2L1.
Το ερώτημα που θέσαμε ανοίγει το δρόμο περαιτέρω διερεύνησης αυτών των μεταγράφων, μελέτη της αλληλουχίας και της πιθανής λειτουργίας τους. Σε επόμενο στάδιο, αυτό θα μπορούσε να συμβάλλει στην αποσαφήνιση του ρόλου του γονιδίου BCL2L1 στην απόπτωση, καθώς και σε άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια.
(EL)
Members of the BCL2 gene family play a prominent role in apoptosis, an active process of deliberate cell self-destruction, most known as programmed cell death. According to structural and functional characteristics, the proteins of the BCL2 family share one to four homologous BH domains (BH domains), namely BH1, BH2, BH3 and BH4. These domains mediate the heterodimeric and homodimeric interactions between members of the BCL2 family, thus playing a critical role in their function. BCL2 family proteins are classified according to their apoptotic activity into two subfamilies, the anti-apoptotic proteins, the pro-apoptotic proteins. In terms of their structure, the anti-apoptotic proteins include all four BH domains along with a transmembrane region TM. On the other hand, the anti-apoptotic proteins are characterized by the absence of the BH4 domain, while there are pro-apoptotic proteins, the BH3-only proteins, which bear only the BH3 domain.
Alternative splicing (AS) is a post-transcriptional process via which new mRNA transcripts derive from a precursor mRNA molecule. These transcripts often encode structurally and perhaps functionally different protein isoforms, which have been associated with different cellular functions. One of the best known examples is that of the BCL2L1 (or BCL-X) gene, a member of the BCL2 gene family. Transcripts are generated from this gene, through alternative splicing, which encode two distinct protein isoforms with distinct, and even opposite functions. The longest protein isoform BCLXL has been found to have pro-apoptotic activity, while the smallest BCLXS has anti-apoptotic activity. The aim of the present thesis was investigation of the transcripts of this gene.
We started the research with an extensive bioinformatics analysis, in order to collect all the recorded knowledge about the BCL2L1 gene. Based on the data we collected, we conducted a series of experiments that included, mainly, the techniques of reverse transcription, simple PCR, and nested PCR. Thus, we came to the conclusion that 24 new alternative transcripts of the BCL2L1 gene may exist.
The question we posed paves the way for further investigation of these transcripts, study of their sequence and possible function. At a later stage, this could help elucidate the role of the BCL2L1 gene in apoptosis, as well as other cellular pathways.
(EN)