Στην παρούσα διπλωματική εργασία διερευνάται ο ρόλος και η έκφραση μιας
flavodoxin-like πρωτεΐνης, καθώς και η πιθανή της κατανομή σε συγκεκριμένες δομές
της πλασματικής μεμβράνης, τα εισοσώματα. Ο μικροοργανισμός στον οποίο
μελετιούνται οι εισοσωμικές πρωτεΐνες είναι ο οργανισμός μοντέλο Aspergillus nidulans.
Συγκεκριμένα, εξετάζεται ποια είναι η λειτουργία και η υποκυτταρική κατανομή της
πρωτεΐνης PstB στο συγκεκριμένο μικροοργανισμό. Στο ζυμομύκητα Saccharomyces
cerevisiae η πρωτεΐνη Pst2, ομόλογη της PstB, είναι γνωστό πως εμφανίζει εισοσωμική
κατανομή, ενώ επιπλέον έχει λυθεί η δομής της μέσω κρυσταλλογραφίας, και είναι
γνωστό ότι εμφανίζει ενεργότητα οξειδοαναγωγάσης κινονών. Επιπλέον της Pst2, o
ζυμομύκητας διαθέτει 2 ακόμα μέλη της Ιδίας οικογένειας πρωτεϊνών, τις Ycp4 και Rfs1.
Η Pst2 του S. cerevisiae εμφανίζει 60% ομοιότητα με την πρωτεΐνη PstB του A.
nidulans, η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο AN0297. Στην εργασία αυτή
πραγματοποιήθηκε σύντηξη της Pst2 πρωτεΐνης με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη
(GFP), χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της Fusion PCR. Η σύντηξη πραγματοποιήθηκε με
την εισαγωγή στο γονιδιωματικό τόπο του AN0297 αλληλουχίας που κωδικοποιεί για
την GFP, ακολουθούμενη από κατάλληλο γονίδιο επιλογής. Πιο συγκεκριμένα,
κατασκευάστηκε κασέτα pstB::gfp::AfPyrG, η οποία ενσωματώθηκε στο γονιδιωματικό
τόπο του ΑΝ0297 μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού μετά από μετασχηματισμό ενός
στελέχους φυσικού τύπου ως προς την πρωτεΐνη PstB. Η σωστή ενσωμάτωση
ελέγχθηκε με PCR, και στη συνέχεια μελετήθηκε η υποκυτταρική κατανομή της
συγκεκριμένης πρωτεΐνης στον μικροοργανισμό, με τη βοήθεια συνεστιακής
μικροσκοπίας επιφθορισμού. Πιο συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε διασταύρωση με
στέλεχος που εκφράζει την πρωτεΐνη PilA-mRFP, ένα γνωστό δείκτη των εισοσωμάτων
στον A. nidulans, με σκοπό να διερευνηθεί η εισοσωμική κατανομή της PstB μέσω
συνεντοπισμού της με την PilA-mRFP. Επιπλέον, μελετήθηκε η υποκυτταρική κατανομή
της PstB σε στελέχη που δεν εκφράζουν την PilA (pilAΔ), η οποία είναι και ο κύριος
οργανωτής των εισοσωμάτων. Τέλος, έγινε προσπάθεια να ελεγχθεί η λειτουργικότητα
της χιμαιρικής πρωτεΐνης PstB::GFP με δοκιμασίες ανάπτυξης παρουσία μεναδιόνης,
μιας κινόνης που προκαλεί οξειδωτικό στρες. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η
PstB του A. nidulans δεν εντοπίζεται στα εισοσώματα, σε αντίθεση με τις ομόλογες
πρωτεΐνες του ζυμομύκητα, και δεν εμφανίζει ενεργότητα οξειδοαναγωγάσης κινονών.
(EL)
The present thesis investigates the role of a flavodoxin-like protein (FLP), and
its potential distribution to specialized domains of the plasma membrane, the
eisosomes.
The microorganism in which the study is conducted is the model organism
Aspergillus nidulans. More specifically, it is examined what is the physiological role and
the subcellular distribution of the PstB protein in this filamentous fungus. In the yeast
Saccharomyces cerevisiae, the Pst2 protein, homologue of PstB, is known to have
eisosomal distribution, while its three-dimensional crystal structure has been resolved,
and is known to have quinone-oxidoreductase activity. In addition to Pst2, the genome
of this yeast codes for two additional members of FLP family, named Ycp4 and Rfs1.
Pst2 of S. cerevisiae shows 60% similarity to PstB of A. nidulans, which is coded by the
gene AN0297. In this thesis, PstB was fused to the green fluorescent protein (GFP)
using fusion PCR. The fusion was performed by insertion at the genomic locus of
AN0297 of the sequence coding for GFP, followed by an appropriate selection marker.
More specifically, the constructed pstB::gfp::AfPyrG cassette was integrated in the
genomic locus of AN0297 by homologous recombination, after transformation of an A.
nidulans strain that was wild type for PstB. Proper integration was verified by PCR, and
the subcellular localization of PstB-GFP was investigated using confocal laser
microscopy. More specifically, the A. nidulans strain expressing PstB-GFP was crossed
to a strain expressing PilA-mRFP, a well-known eisosomal marker in A. nidulans, to
check the potential co-localization of the two proteins. In addition, the distribution of
PstB-GFP in a strain not expressing the main eisosomal organizer, PilA, was
investigated. Finally, the functionality of the PstB-GFP protein was assessed by growth
tests in menadione, a quinone that promotes oxidative stress. The results indicate that
PstB is not an eisosomal protein, contrary to its homologue in yeast, and it does not act
as a quinone-oxidoreductase.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
