Η απόπτωση είναι μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που απομακρύνει κύτταρα που έχουν συσσωρεύσει γενετικές βλάβες, έχουν μολυνθεί από κάποιον ιό ή γενικότερα είναι επικίνδυνα για τον οργανισμό. Πρόκειται για μια αυστηρά ελεγχόμενη διαδικασία που δεν αφήνει πίσω της ίχνη καταπόνησης ή φλεγμονής και σε περίπτωση απορρύθμισης μπορεί να οδηγήσει σε αρκετές επικίνδυνες ασθένειες, όπως ο καρκίνος. Το μονοπάτι που ενεργοποιείται από ενδοκυτταρικά ερεθίσματα καλείται ενδογενές ή μιτοχονδριακό και βασικοί ρυθμιστές του είναι οι πρωτεΐνες της υπεροικογένειας BCL2. Τα μέλη αυτής της οικογένειας μπορεί να έχουν αντι-αποπτωτικό ή προ-αποπτωτικό ρόλο και να αλληλεπιδρούν με ανασταλτική ή θετική επίδραση. Κοινό γνώρισμα των μελών αυτής της οικογένειας είναι η ύπαρξη επικρατειών ομολογίας με την πρωτεΐνη BCL2 που υπήρξε και το πρώτο μέλος της οικογένειας που ανακαλύφθηκε (BCL2 Homology Domain, BH domain). Τα μέλη της οικογένειας διακρίνονται σε τρεις υποομάδες: τις αντι-αποπτωτικές πρωτεΐνες με τέσσερις ΒΗ επικράτειες (ΒΗ1-ΒΗ4), τις προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες τελεστές με τρεις ΒΗ επικράτειες (ΒΗ1-ΒΗ3) και τις προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες με μια μόνο BH3 επικράτεια. Ένα ιδιαίτερο μέλος των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών τελεστών είναι η πρωτεΐνη BOK, που σε αντίθεση με τα υπόλοιπα ομόλογα μέλη της ομάδας της διαθέτει τέσσερις BH επικράτειες. Ο ακριβής ρόλος της στην απόπτωση παραμένει άγνωστος. Υποστηρίζεται ότι σε περίπτωση διαταραχής της ορθής λειτουργίας του ενδοπλασματικού δικτύου ή της συσσώρευσης μη ορθά πτυχωμένων πρωτεϊνών, η BOK παύει να αποικοδομείται στο πρωτεάσωμα και μπορεί να επάγει την απόπτωση άμεσα η ίδια με το σχηματισμό πόρων διαπερατότητας στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη ή έμμεσα σηματοδοτώντας τον ολιγομερισμό των προ-αποπτωτικών μελών τελεστών BAX και BAK. Υποστηρίζεται, ωστόσο ότι έχει και άλλες σημαντικές λειτουργίες μέσα στο κύτταρο, όπως η διατήρηση της σωστής μορφολογίας των μιτοχονδρίων. Τα κυκλικά μόρια RNA (circRNAs) δημιουργούνται με το μηχανισμό της οπισθοσυρραφής (back-splicing) και έχουν αρκετούς διαφορετικούς ρόλους μέσα στο κύτταρο, όπως η πρόσδεση μορίων microRNA ή πρωτεϊνών που προσδένονται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες RNA (RNA Binding Proteins, RBPs), η ρύθμιση της μεταγραφής των γονιδίων και η πιθανή μετάφρασή τους προς την παραγωγή πρωτεϊνικών ισομορφών. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανακάλυψη της έκφρασης νέων circRNAs του γονιδίου BOK σε ανθρώπινες επιθηλιακές κυτταρικές σειρές καρκίνου. Για το σκοπό αυτό, απομονώθηκε RNA από επτά ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, έγινε αντίστροφη μεταγραφή του με τη χρήση τυχαίων εξαμερών εκκινητών και πραγματοποιήθηκαν μια σειρά από αντιδράσεις συμβατικής, επάλληλης και ημι-επάλληλης PCR με τη χρήση αποκλινόντων εκκινητών για την ανίχνευση νέων πιθανών κυκλικών μεταγράφων του γονιδίου. Για το ένα νέο circRNA που ταυτοποιήθηκε με τη μέθοδο αλληλούχισης Sanger στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού SK-BR-3 έγινε προσπάθεια πρόγνωσης της λειτουργίας του με τη χρήση υπολογιστικών εργαλείων. Η πειραματική διερεύνηση των προβλεπόμενων λειτουργιών του ίσως αναδείκνυε το ρόλο του στη λειτουργία του κυττάρου, ενώ η μελέτη της έκφρασής του σε ανθρώπινα βιολογικά δείγματα ίσως οδηγούσε στην ανακάλυψη ενός νέου βιοδείκτη. Τα ευρήματα αυτά, σε συνδυασμό με την ανακάλυψη και άλλων πιθανών circRNAs του γονιδίου BOK, πιθανόν να συμβάλλουν στην εύρεση νέων θεραπευτικών στόχων ή βιοδεικτών και αποτελούν ερωτήματα που θα μπορούσαν να διερευνηθούν στο μέλλον.
(EL)
Apoptosis is a form of programmed cell death in which cells that have accumulated mutations, have been infected with a virus or, in general, are considered perilous or unnecessary, are eliminated. It is a tightly regulated process, which does not leave behind traces of inflammation or stress and dysregulation of this procedure may lead to several diseases, such as cancer. The intrinsic or mitochondrial pathway of apoptosis is activated by intracellular stress stimuli and is regulated mostly by members of the BCL2 protein superfamily. Μembers of this superfamily can directly or indirectly enhance or suppress each other’s function and exhibit pro-apoptotic or anti-apoptotic roles. All members of this family share BCL2 homology domains (BH domains) that resemble the domains of the BCL2 protein, which was the first member of this protein family that has been identified in a type of B cell lymphoma. Based on this feature, the members of this family are divided into three categories: the anti-apoptotic proteins that contain four BH domains (BH1-BH4), the pro-apoptotic proteins effectors that contain three BH domains (BH1-BH3) and the pro-apoptotic proteins that contain only one BH3 domain (BH3-only). An intriguing and newly discovered member of the effectors’ group is the pro-apoptotic protein BOK, which in contrast to other effectors has all four BH domains. Few and controversial studies regarding its role in apoptosis have been conducted and its exact role in the intrinsic apoptotic pathway has not been fully elucidated yet. It is generally accepted that in case of endoplasmic reticulum stress or accumulation of misfolded proteins, BOK is no longer degraded in the proteasome and can induce mitochondrial outer membrane permeabilization and subsequent apoptosis either by itself or by promoting indirectly the oligomerization of the most crucial effectors BAX and BAK. Whether it can induce apoptosis by itself or not, as well as whether it regulates other normal cellular functions, such as the fusion of mitochondria, is not yet clear and needs further investigation. Circular RNAs (circRNAs) are created upon a unique back-splicing mechanism and can have several cellular functions. Their role ranges from binding microRNA molecules and RNA binding proteins to regulating transcription and being translated in order to produce novel protein isoforms. The aim of this dissertation has been the discovery of circRNAs deriving from the BOK gene in human epithelial cancer cell lines. The experimental procedure consisted of total RNA isolation from seven human cell lines, followed by reverse transcription of RNA to cDNA using random hexamers and a series of conventional PCR, Semi-nested PCR or Nested PCR experiments utilizing various divergent primers to discover potential circRNAs originating from the BOK gene. Ultimately, a novel circRNA has been identified using Sanger Sequencing and has been found to be greatly and specifically expressed in SK-BR-3 breast cancer cells. Subsequently, several computational tools have been utilized to predict its potential cellular function. Besides the experimental validation of its potential role, analysis of its expression profile in patient-derived breast cancer samples may reveal an original biomarker for this disease. Consequently, these findings may lead to the discovery of new therapeutics or biomarkers, and it is essential that the function and the expression profile of many more BOK-circRNAs are investigated in the future.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
