Στα φυτά, υπάρχουν εξειδικευμένες αλληλουχίες σύνδεσης μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίες ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε εξειδικευμένες αναπτυξιακές διεργασίες ή βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν και οι αλληλουχίες SMRE και SNBE που εντοπίζονται σε ποικίλες θέσεις του υποκινητή του γονιδίου VPNB1 του φυτού Arabidopsis thaliana. Το γονίδιο VPNB1, εκφράζεται αποκλειστικά στο αγωγό σύστημα του φυτού και φαίνεται να συμμετέχει στην βιογένεση και διαφοροποίησή του, καθώς έχει βρεθεί ότι εκφράζεται στα κύτταρα του καμβίου, του φλοιώματος και του διαφοροποιούμενου ξυλώματος. Το τελευταίο στάδιο της διαφοροποίησης των ξυλωματικών κυττάρων είναι η διαδικασία της εναπόθεσης δευτερογενών τοιχωματικών παχύνσεων. Αυτή περιλαμβάνει ένα πολύπλοκο δίκτυο μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι αναγνωρίζουν τα στοιχεία σύνδεσης SMRE και SNBE. Στην παρούσα μελέτη, έγινε ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου VPNB1 με διαδοχικές απαλοιφές ρυθμιστικών στοιχείων (promoter deletion analysis). Για τον σκοπό αυτό, έγινε ποιοτική και ποσοτική μελέτη διαγονιδιακών σειρών -που έφεραν κατασκευές μεταγραφικής σύντηξης του υποκινητή VPNB1 με το γονίδιο αναφοράς GUS- με δοκιμασία χρώσης κατά GUS και φθορισμομετρία, αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν ορισμένες σειρές σε κυτταροκαλλιέργειες VISUAL (Vascular cell Induction culture Using Arabidopsis Leaves), ως προς την απόκριση διαφοροποίησης των μεσοφυλλικών κυττάρων σε τραχειακά στοιχεία. Τα αποτελέσματα των ποσοτικών πειραμάτων έδειξαν ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική μείωση της ενεργότητας του υποκινητή όταν αφαιρείται 1 SNBE που βρίσκεται στη θέση -1422, 1 SMRE στη θέση -1247, 1 SNBE στη θέση -1146 και 1 SNBE στη θέση -1041 διαδοχικά, τόσο στα αρτίβλαστα 3 και 8 ημερών όσο και σε αναπαραγωγικούς ιστούς (άνθη). Επίσης, τα αποτελέσματα των ποιοτικών πειραμάτων για το SMRE και τα δύο SNBE στις θέσεις -1247, -1146 και -1041 αντίστοιχα επιβεβαίωσαν τα ποσοτικά αποτελέσματα, καθώς η διαδοχική απαλοιφή τους επηρέαζε είτε την ένταση είτε την έκταση της χρώσης είτε και τα δύο. Τέλος, το πρωτόκολλο VISUAL οδήγησε σε επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου VPNB1 σε όλες τις επιλεγμένες σειρές. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα δύο υπό μελέτη ρυθμιστικά στοιχεία SMRE και SNBE δρουν συνεργιστικά στην επαγωγή του υποκινητή και την έκφραση του γονιδίου VPNB1 κατά τη διάρκεια ανάπτυξης και διαφοροποίησης του αγωγού συστήματος του φυτού A. thaliana και ότι η παρουσία τους είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση των μεσσοφυλλικών κυττάρων σε τραχειακά στοιχεία.
(EL)
In plants, several specific transcription factor binding sites and their respective transcriptional factors (TFs) regulate the expression of genes involved in various developmental processes and/or biotic and abiotic stress responses. Two of these elements are the SMRE and SNBE binding sites, that are located at multiple sites within the Arabidopsis thaliana VPNB1 promoter. The VPNB1 gene is expressed exclusively in the plant vascular tissue and seems to be involved in the biogenesis and differentiation of the vascular cambium, the phloem, and the xylem cells. The final step during xylem differentiation comprises the deposition of secondary cell wall materials. The latter involves a highly complex network of transcriptional factors, which bind among other sites, to the SMRE and SNBE promoter elements. During this study, a promoter deletion analysis of the VPNB1 gene was carried out. In this context, several promoter::GUS transgenic lines, harboring various fragments of the Arabidopsis thaliana VPNB1 promoter, were analyzed both quantitatively and qualitatively by using colorimetric GUS-staining and fluorometry, respectively. VISUAL (Vascular cell Induction culture Using Arabidopsis Leaves) was also performed on selected transgenic lines, to investigate the responsiveness of the VPNB1 promoter in the differentiation of mesophyll cells into tracheary elements. The quantitative results showed a statistically significant reduction of promoter activity, in both 3 and 8 DAS (Days After Sowing) seedlings as well as reproductive tissues (flowers), by the sequential deletion of the SNBE located in -1422, the SMRE at position -1247, the SNBE at position -1146 and SNBE at position -1041. Furthermore, the qualitative GUS-staining assays confirmed that the deletion of the SMRE and the two SNBEs located at position -1247, -1146 and -1041, respectively, affected the GUS staining pattern. Finally, the VISUAL experiments showed that the tissue cultures responded to the induction, as strong GUS staining was evident in all the transgenic lines used. Taken together, the results indicate that the SNBE and SMRE transcription factor binding sites located within the VPNB1 regulatory sequences act cooperatively in promoter induction and consequently in VPNB1 gene expression during vascular development and differentiation. VISUAL, on the other hand, confirmed that the SNBE and SMRE promoter elements are essential for the differentiation of mesophyll cells into tracheary elements.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
