Η Προθυμοσίνη α (ΠροΤα) αποτελεί ένα εξελικτικά συντηρημένο πολυπεπτίδιο των
θηλαστικών (μήκους 109 αμινοξέων στον άνθρωπο), το οποίο εμφανίζει
πλειοτροπικήανοσοενισχυτική δράση. Το αμινο(Ν)-τελικό θραύσμα [1-28] του
μορίου, το οποίο ταυτίζεται με το ανοσοενισχυτικό πεπτίδιο Θυμοσίνη α1 (Τα1)
θεωρήθηκε αρχικά ως η ανοσοδραστική περιοχή του πολυπεπτιδίου. Πρόσφατα όμως
δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ΠροΤα ασκεί μια διακριτή ανοσοεπαγωγική δράση μέσω
του καρβοξυ(C)-τελικού της θραύσματος [100-109] ή της κεντρικής περιοχής
[51-89], στοχεύοντας τον υποδοχέα τύπου Toll 4 (TollLikeReceptor 4, TLR4). Στα
πλαίσια της παρούσας διατριβής, αναπτύχθηκε ένα εξειδικευμένο παράγωγο της
C-τελικής περιοχής ΠροΤα[100-109] (ΠροΤα-D1), ικανό να ραδιοεπισημανθεί με
τεχνήτιο-99m (99mTc). Η ανοσοδραστικότητα του συμπλόκου του νέου παραγώγου με
μη ραδιενεργό ρήνιο (185/187Re) ([185/187Re]ΠροΤα-D1), δομικά όμοιο με το
[99mTc]ΠροΤα-D1, αξιολογήθηκε in vitro σε κατάλληλη ανοσοδοκιμασία και σε
δοκιμασία κινητικής μελέτης της επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4 σε
ανθρώπινα ουδετερόφιλα, συγκριτικά πάντα με την αντίστοιχη δραστικότητα του
ακέραιου μορίου της ΠροΤα, διαφόρων πεπτιδικώνΠροΤα-παραγώγων αλλά και
κατάλληλων αρνητικών μαρτύρων. Μελέτες κυτταρικής δέσμευσης που ακολούθησαν
αποκάλυψαν εξειδικευμένη πρόσδεση του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα
ουδετερόφιλα, η οποία είναι χρονο-εξαρτώμενη, υπόκειται σε κορεσμό και
αναστέλλεται από την παρουσία του ακέραιου μορίου της ΠροΤα, του θραύσματος
ΠροΤα[100-109] και του λιποπολυσακχαρίτη LPS, αλλά όχι από την Τα1, το κεντρικό
θραύσμα ΠροΤα[51-89] και τους αρνητικούς μάρτυρες. Τα αποτελέσματα αυτά
υποστηρίζουν την ύπαρξη ειδικών θέσεων πρόσδεσης της ΠροΤα σε ανθρώπινα
ουδετερόφιλα, οι οποίες αναγνωρίζουν την C-τελική περιοχή ΠροΤα[100-109] και
πιθανότατα εμπλέκουν τον υποδοχέα TLR4. Χάρη στις ιδιότητες του ραδιοϊσοτόπου
που χρησιμοποιήθηκε για την επισήμανση του παραγώγου, το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-
D1 αξιολογήθηκε περαιτέρω σε in vivo μελέτες βιοκατανομής και απεικόνισης σε
μοντέλο φλεγμονής σε ποντίκια. Οι μελέτες αυτές έδωσαν σημαντικές πληροφορίες
φαρμακοκινητικής φύσεως αλλά κυρίως κατέδειξαν την ικανότητα του [99mTc]ΠροΤα-
D1 για εκλεκτική στόχευση εστιών φλεγμονής. Η στρατολόγηση του [99mTc]ΠροΤα-D1
σε τόπους φλεγμονής, με βάση και τα αποτελέσματα κ
ατάλληλου αρνητικού μάρτυρα, είναι ειδική και οφείλεται στην παρουσία της
C-τελικής περιοχής ΠροΤα[100-109]. Συνολικά, η παρούσα διατριβή συνέβαλλε στη
συλλογή σημαντικών πληροφοριών για την αποσαφήνιση του εξωκυτταρικού ρόλου της
ΠροΤα, οι οποίες θα διευκολύνουν την πιθανή μελλοντική αξιοποίηση του
πολυπεπτιδίου ή και του μικρότερου C-τελικού δεκαπεπτιδίουΠροΤα[100-109] στην
κλινική πράξη.
(EL)
Prothymosin alpha (ProTα) is a conserved mammalian polypeptide (human sequence
109 amino acid-long) exerting a pleiotropic immunoenhancing activity. The
N-terminal fragment [1-28] of the molecule, which is identical with the
immunostimulating peptide thymosinα1 (Tα1), was earlier considered as the
immunoactive region of the polypeptide; however, recent data suggest that ProTα
may exert a discrete immunomodulating action through its C-terminal decapeptide
[100-109] or its central region [51-89], via targeting Toll-like receptor- 4
(TLR4). In the frame of this work, a derivative of the C-terminal fragment
ProTα[100-109] (ProTα-D1) that can be radiolabeled with 99mTc was developed.
The biological activity of the non-radioactive 185/187rhenium-complex of this
derivative ([Re]ProTα-D1,structurally similar with [99mTc]ProTα-D1) was
evaluated in suitable in vitro bioassays and in assays correlated with TLR4
surface expression using human neutrophils, in comparison with intact ProTα,
various synthetic ProTα fragments/derivatives and negative control peptides.
Subsequent cell-binding studies revealed specific, time-dependent and saturable
binding of [99mTc]ProTα-D1 on neutrophils, which was inhibited by intact ProTα
and the synthetic ProTα[100-109], as well as by a “prototype” TLR4-ligand
(lipopolysaccharide from Escherichia coli, LPS), but not by synthetic Τα1, the
central ProTα region and negative control peptides. Our results support the
existence of ProTα-binding sites on human neutrophils, recognizing the
C-terminal region [100-109], which might involve TLR4. Due to the properties of
the radioisotope used for the labeling, [99mTc]ProTα-D1 was further evaluated
in in vivo biodistribution and whole body imaging studies in mice bearing an
inflammation model. These studies provided important information related to the
pharmacokinetic profile of [99mTc]ProTα-D1 but above all revealed the capacity
of [99mTc]ProTα-D1 to selectively target inflammatory loci in vivo. The
accumulation of [99mTc]ProTα-D1 in inflammatory sites is specific and due to
the presence of the C-terminal decapeptideProTα[100-109]. Overall, the present
thesis significantly contributed to the enrichment of our basic knowledge on
the extracellular mode of action of ProTα, both in vitro and in vivo.
Additionally, such data will facilitate future exploitation of the polypeptide
or a smaller active fragment thereof, such as ProTα[100-109], in the clinical
setting.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
