Στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του in vivo ρόλου ενός αναστολέα του κυτταρικού κύκλου ονόματι Geminin που αλληλεπιδρά με σύμπλοκα αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό του ανοσοποιητικού συστήματος. Χρησιμοποιώντας το σύστημα Cre-loxP, δημιουργήσαμε μύες που επιτρέπουν την υπό συνθήκη εξάλειψη (knockout) του γονιδίου της geminin, πλαισιώνοντας τα εξώνια τρία και τέσσερα του γονιδίου της με θέσεις IoxP σε pc3 εμβρυϊκά πολυδύναμα κύτταρα μυός. Τα κύτταρα ενέθηκαν στη συνέχεια σε βλαστοκύστεις για τη δημιουργία χιμαιρικών μυών που εκφράζουν την Cre ρεκομπινάση στη γαμετική σειρά. Από διασταυρώσεις των τελευταίων, δημιουργήθηκαν μύες που έφεραν το πλαισιωμένο με ΙοχΡ θέσεις αλληλόμορφο της Geminin (floxed-TKneo), καθώς επίσης και το πλήρες knockout (ΔGEM). Από διασταυρώσεις ΔGEM+/-μυών δεν προέκυψαν ομόζυγοι μύες για το ΔGEM αλληλόμορφο. Φαινοτυπική ανάλυση των ετερόζυγων ΔGEM μυών με κυτταρομετρία ροής ανέδειξε αύξηση των επιπέδων των διπλά αρνητικών Thy1⁻¹/Β220⁻ κυττάρων σε σπλήνα και λεμφαδένες ενήλικων μυών και αύξηση των CD8⁺. Σε παραπλήσια αποτελέσματα οδηγηθήκαμε και μετά από την ανάλυση των knockout για το γονίδιο της Geminin(GT) μυών που δημιουργήσαμε με τη μεθοδολογία της παγίδευσης γονιδίων. Τα ετερόζυγα GT ζώα διασταυρώθηκαν με ετερόζυγα ζώα για το πλήρες knockout του BRG1 και με ετερόζυγα ζώα που υπερεκφράζουν μια επικρατούσα κατασταλτική μορφή του BAF57, προκειμένου να διαπιστωθεί με ανάλυση με FACS εάν υπάρχει γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ της Geminin και των συγκεκριμένων μελών του συμπλέγματος αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF. Πράγματι, η Geminin φαίνεται να συνεργάζεται με το σύμπλεγμα SWI/SNF στη ρύθμιση των CD4 κυττάρων του θύμου αδένα και των CD8 του σπλήνα. Ιστοειδικά, χρησιμοποιώντας την floxedTKneo σειρά μυών σε συνδυασμό με την CD2-Cre, που επιτρέπει την εξάλειψη του γονιδίου σε πολυδύναμους κυτταρικούς πληθυσμούς του θύμου, είδαμε ότι η πλήρης εξάλειψη της Geminin δεν έχει καμία επίπτωση στην ανάπτυξη του θύμου αδένα, ενώ αντίθετα στο σπλήνα εμφανίζονται μειωμένοι οι πληθυσμοί των ώριμων CD4 και CD8T λεμφοκυττάρων, οι οποίοι μετά από μιτωγονική διέγερση με ConA αδυνατούν να διαιρεθουν. Τέλος, έγινε προσπάθεια για ιστοειδική υπερέκφραση στο ανοσοποιητικό σύστημα της hGeminin συντηγμένης με τη φθορίζουσα χρωστική GFP. Ενώ προέκυψαν ιδρυτές τόσο με χαμηλή όσο και με υψηλή ενσωμάτωση του διαγονιδίου, η έκφραση της GFP δεν κατέστη δυνατόν να ανιχνευθεί με FACS.
In this thesis we wished to investigate the in vivo role of a cell cycle inhibitor named Geminin that interacts with chromatin remodeling complexes, in differentiation and cycle regulation of the immune system. Using Cre-loxP system, we generated conditional knockout mice for Geminin's gene, flanking exons three and four with ΙοχΡ sites in pc3 mouse embryonic stem cells. Targeted pc3 cells were injected into blastocysts for the generation of chimeric mice that expressed Cre recombinase in their germ line. Subsequent crosses of the latter to wild type mice generated heterozygote mice for the flanked by IoxP sites allele of Geminin ("floxed-TKneo") and the complete knockout allele of Geminin (ΔGEM) that was deprived of exons three and four. From ΔGEM+/- intercrosses we didn't recover any homozygote knockout mice. Phenotypic analysis of ΔGEM+/- mice by FACS revealed a dramatic increase in Thy1⁻¹/Β220⁻ cells from spleen and lymph nodes from ΔGEM +/- adult mice and a significant increase in CD8+ Τ cells from lymph nodes. Similar results were obtained from the analysis of the GT knockout mice that we generated, using a gene trap mutagenesis approach. GT heterozygote mice were crossed with heterozygote mice for BRG1 knockout and with heterozygote mice that overexpressed a dominant negative form of BAF57, so as to investigate by FACS analysis, whether there is a genetic interaction between Geminin and the two members of the SWI/SNF chromatin remodeling complex. Indeed Geminin seems to operate with SWI.SNF complex for the regulation of thymic CD4 and splenic CD8. Using floxed-TKneo and CD2-Cre mouse lines, that allowed the deletion of the gene from the earliest thymic Τ cell progenitors stage and on, we were surprised to see that in the Geminin conditional knockout mice, thymic development was largely unaffected whereas mature CD4 and CD8 Τ cells in the spleen were drastically reduced and unable to divide upon mitogenic stimulation with ConA. Finally, we tried to overexpress human Geminin tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) specifically in the immune system. We obtained founders for all of the cloned constructs, both with low and high copy transgene integration, but we were unable to detect GFP expression by FACS analysis.
